Broadening substrate specificity of a chain-extending ketosynthase through a single active-site mutation

Murphy, Annabel C.; Hong, Hui; Vance, S.; Broadhurst, R. William; Leadlay, Peter F.

doi:10.1039/c6cc03501a

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“…[8] Recently, a single point mutation to the third KS of the erythromycin synthase was observed to greatly relax its substrate specificity. [9] This mutation is in a loop that, as Abe and co-workers describe, might play the role of a filter that enables KSs to specify a single intermediate generated by the preceding processing enzymes. The authors also determined that ATs evolutionarily migrate between module types independent of other domains, noting that the ATs of one assembly line are more closely related than equivalent ATs from different assembly lines.…”

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Polyketide Synthase Modules Redefined

Keatinge‐Clay

2017

Angew Chem Int Ed

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Polyketide Synthase Modules Redefined

Keatinge‐Clay

2017

Angew Chem Int Ed

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“…Submission of the KS3-AT3 and KS6-AT6 didomains and selection of the target residues within FuncLib (including the possibility of a tryptophan at A154KS3 and A124KS6) 26 resulted in a sequence space of 152,826 designs for KS3-AT3 and 285,822 designs for KS6-AT6 with a large variability in mutated residues (Table S1). In a next step, Rosetta calculation revealed that from the initial designs 1,011 designs for KS3-AT3 and 3,683 designs for KS6-AT6 result in more stable proteins than the respective wild-type proteins.…”

Section: Results and Discussion Design Of Ks Multipoint Mutants-mentioning

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“…In addition, the previously reported single point mutants A154WKS3 and A124WKS6 were also generated as a reference. 26 The mutations are predicted to change the geometry of the respective active sites, potentially leading to different properties in substrate binding or catalysis (Figures S3&S4).…”

Section: Results and Discussion Design Of Ks Multipoint Mutants-mentioning

confidence: 99%

“…15,25 Identification of the KS domain as a bottleneck in PKS turnover is further supported by a recent mutagenesis study on DEBS KS3 in which single point active site mutagenesis resulted in significantly broadened substrate specificities and higher turnover rates. 26 Based on the observation that the KS domains of the mycolactone synthase (MYCL) share a >97% sequence identity, despite accepting substrates of different length and chemical modification, DEBS KS3 residues were replaced with their counterparts from MYCL, resulting in one particular point mutant (A154WKS3) with significantly increased promiscuity compared to wild-type KS3. 26 Polyketide intermediates are shown as attached to the respective acyl carrier protein (ACP).…”

Section: Introductionmentioning

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The Ketosynthase Domain Constrains the Design of Polyketide Synthases

Klaus

Buyachuihan

Grininger

2020

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Modular polyketide synthases (PKSs) produce complex, bioactive secondary metabolites in assembly line-like multistep reactions. Longstanding efforts to produce novel, biologically active compounds by recombining intact modules to new modular PKSs have mostly resulted in poorly active chimeras and decreased product yields. Recent findings demonstrate that the low efficiencies of modular chimeric PKSs also result from rate limitations in the transfer of the growing polyketide chain across the non-cognate module:module interface and further processing of the non-native polyketide substrate by the ketosynthase (KS) domain. In this study, we aim at disclosing and understanding the low efficiency of chimeric modular PKSs and at establishing guidelines for modular PKSs engineering. To do so, we work with a bimodular PKS testbed and systematically vary substrate specificity, substrate identity, and domain:domain interfaces of the KS involved reactions. We observe that KS domains employed in our chimeric bimodular PKSs are bottlenecks with regards to both substrate specificity as well as interaction with the ACP. Overall, our systematic study can explain in quantitative terms why early oversimplified engineering strategies based on the plain shuffling of modules mostly failed and why more recent approaches show improved success rates. We moreover identify two mutations of the KS domain that significantly increased turnover rates in chimeric systems and interpret this finding in mechanistic detail.

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“…[7] Künstliche PKSs erwiesen sich als aktiver, wenn die einer Gruppe prozessierender Enzyme nachgeschaltete KS diejenige ist, die diesen Domänen in der nativen PKS nachgeschaltet ist. [9] Diese Mutation befindet sich in einer Schleife,d ie laut Abe et al eine Rolle als Filter spielen kçnnte,d er es KSs ermçglicht, ein einzelnes,von den vorhergehenden prozessierenden Enzymen generiertes Intermediat spezifisch zu erkennen. [9] Diese Mutation befindet sich in einer Schleife,d ie laut Abe et al eine Rolle als Filter spielen kçnnte,d er es KSs ermçglicht, ein einzelnes,von den vorhergehenden prozessierenden Enzymen generiertes Intermediat spezifisch zu erkennen.…”

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Polyketidsynthase‐Module: eine Neudefinition

Keatinge‐Clay

2017

Angewandte Chemie

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Biosynthese ·Enzymologie ·E volutionsgeleitetes Engineering ·Module ·PolyketideSeit vor 27 Jahren die Sequenz der enzymatischen Biosynthesemaschinerie fürd en Aufbau des Kohlenstoffgerüsts des Polyketid-Antibiotikums Erythromycin bestimmt wurde, nennt man Gruppen von Domänen, die sich innerhalb solcher Polyketidsynthasen (PKSs) wiederholen, "Module", in Analogie zur Domänenanordnung in der Fettsäuresynthase von Säugetieren. [1] Vorkurzem berichteten Abe und Mitarbeiter, dass die Domänengruppen, die in der Evolution der PKS-Biosynthesemaschinerie genetisch gemeinsam migrieren, nicht unter diese Definition fallen. [2] Studenten hçren oft erstmals von modularen PKSs in einführenden Biochemiekursen im Zusammenhang der Palmitat-Biosynthese durch die Fettsäuresynthase aus Säugetieren. [3] Sie erfahren, dass Enzymdomänen mit Acyl-Carrier-Protein(ACP)-Domänen kooperieren, um eine Starter-Acylgruppe mit Kohlenstoffverlängerungseinheiten zu elongieren und eine längere Acylkette zu generieren, deren chemische Eigenschaften von den Enzymen eingestellt werden, mit denen sie während ihrer Synthese interagiert. Eine Acyltransferase (AT) selektiert das Monomer,d as von einer Ketosynthase (KS) an die wachsende Kette kondensiert wird, und prozessierende Enzyme modifizieren den Bereich um die so gebildete b-Ketogruppe.Die prozessierenden Enzyme der Polyketid-Biosynthesemaschinerie sind äquivalent zu jenen der Säuger-Fettsäuresynthase,i nd er eine Ketoreduktase (KR) die b-Ketogruppe stereoselektiv reduziert, eine Dehydratase (DH) die resultierende b-Hydroxygruppe dehydratisiert und eine Enoylreduktase (ER) den b-Kohlenstoff zu einer Methylengruppe reduziert. Eine Thioesterase (TE) am C-Terminus dieser Synthasen setzt das Endprodukt üblicherweise durch Hydrolyse oder Cyclisierung frei. Da die Domänen der Säuger-Fettsäuresynthase gemäßK S + AT + DH + ER + KR + ACP + TE angeordnet sind, wurden die Module der Polyketid-Biosynthesemaschinerie äquivalent definiert:Beginn mit einer KS,Abschluss mit einem ACPund im Mittelbereich optionale prozessierende Enzyme.Abe und Mitarbeiter haben nun berichtet, dass in der Evolution der Biosynthesemaschineriep rozessierende Enzyme gemeinsam mit der nachgeschalteten und nicht mit der vorgeschalteten KS migrieren (Abbildung 1). Sie beobachteten dies durch Vergleich von vier der grçßten bekannten PKSs (jede 25-30 Module lang und ca. fünfmal so schwer wie das bakterielle Ribosom), welche die Aminopolyole Mediomycin, Neomediomycin, ECO-02301 und Neotetrafibricin [*] Prof. A. T.

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Broadening substrate specificity of a chain-extending ketosynthase through a single active-site mutation

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