Bioprospección de enzimas de interés biotecnológico producidas por levaduras antárticas: producción, caracterización y aplicaciones industriales

Abstract

La bioprospección de enzimas entre microorganismos extremófilos es una herramienta utilizada en los últimos años para seleccionar enzimas que catalicen las reacciones en condiciones extremas, teniendo en cuenta su carácter biológico. Particularmente, las ventajas de utilizar enzimas provenientes de microorganismos adaptados al frío radican en la posible reducción de la temperatura de algunos procesos, con la consecuente reducción de la energía a aportar al proceso. Este trabajo de tesis se enfocó en la búsqueda de enzimas producidas por levaduras antárticas, su producción y caracterización bioquímica, así como también la evaluación de su potencial para ciertas aplicaciones. El trabajo inició a partir del a aislamiento de 32 cepas de levaduras a partir de muestras antárticas. Entre ellas, se observó la prevalencia de Basidiomicetos de los géneros Naganishia, Holtermaniella, Vishniacozyma, Phenoliferia, Mrakia y Cystobasidium. Seis de las cepas fueron caracterizadas como Ascomicetos de los géneros Metschnikowia y Debaryomyces. Se pudo determinar que el 40% de las levaduras aisladas fueron psicrófilas, dejando un 60% restante de psicrotolerantes. En general se observó una media a alta tolerancia a la presencia de NaCl, habiendo algunos aislamientos que toleraron hasta 3.5 M de NaCl para su crecimiento. También se evaluó la tolerancia a los iones Ni+2, Zn+2, Cu+2, Li+ y Cd+2. Entre estos, el Cu+2 y el Cd+2 son los que resultaron más tóxicos, inhibiendo el crecimiento de la mayoría de los aislamientos. La bioprospección de enzimas hidrolíticas demostró una alta proporción de aislamientos produciendo β-glucosidasas (59%) y esterasas (53%). Sólo algunas levaduras produjeron pectinasas y xilanasas (19% y 12.5%, respectivamente), y las proteasas sólo fueron producidas por aislamientos psicrófilos. Otra de las aplicaciones de levaduras extremófilas y sus enzimas es en la decontaminación de efluentes. En este trabajo se realizó una primera evaluación de la capacidad de estas levaduras de decolorar medio suplementado con colorantes textiles. Los géneros Vishniacozyma, Cystobasidium, Mrakia y Phenoliferia parecen ser los más promisorios para continuar con el estudio de biodecoloración de este tipo de colorantes. La cepa Mrakia sp. LP 7.1.2016, que produjo seis de las ocho actividades hidrolíticas evaluadas, se seleccionó para estudiar la producción de pectinasas y β-glucosidasas en medio líquido. Se utilizó pectina como inductor, y se observó que la producción de las enzimas fue fuertemente afectada por la temperatura de cultivo, siendo mayor la expresión a 14 °C respecto de 3 °C. El cultivo fue escalado en un cultivo Batch a 14 °C, y, al final del crecimiento, se obtuvieron títulos de β-glucosidasa de 24 mU ml-1 y de poligalacturonasa de 0.76 U ml-1. Se detectaron en el cultivo una β-glucosidasa (BGLasa) y dos poligalacturonasas (PGasaI y PGasaII). La BGLasa fue purificada 62 veces hasta una preparación homogénea, con un rendimiento del proceso de 51% y actividad específica final de 27 U mg-1. La proteína demostró un alto peso molecular, con al menos dos subunidades de 134 y 14 kDa. La PGasaI se pudo purificar hasta un 83% de pureza, y se le determinó un peso molecular de 33 kDa. Se consiguió una muestra con 30.3 U mg-1 de actividad específica, con un rendimiento del proceso de 27.6%. Por su lado, la PGasaII fue purificada 456 veces, y se obtuvo una preparación con 12551.9 U mg-1 de actividad específica. El rendimiento fue 2% y el peso molecular estimado fue cercano a 100 kDa. Todas las enzimas fueron activas en zimogramas específicos. La caracterización bioquímica demostró temperaturas óptimas de 55 °C, 47 °C y 55 °C para las BGLasa, PGasaI y PGasaII, respectivamente. El pH óptimo de reacción fue cercano a 5.0 en todos los casos. La BGLasa y PGasaII presentaron una termoestabilidad alta, mientras que la PGasaI fue más termolábil. Todas las enzimas fueron sumamente estables a la variación de pH en un rango considerable (3.0-10.0), durante 1 hora. La BGLasa fue parcialmente inhibida por Co+2 (70% de actividad residual), mientras que los iones divalentes Ca+2, Mg+2 y Mn+2 generaron un efecto positivo (14-19%) sobre la actividad. En el caso de las PGasas, ambas fueron inhibidas por Hg+2. Se calcularon los parámetros cinéticos de las enzimas estudiadas y sus especificidades de sustrato. Se pudo determinar que las PGasas estudiadas poseen un mecanismo de acción del tipo endo. Las BGLasas son utilizadas para liberar volátiles aromáticos a partir de sus precursores glucosídicos durante la producción de vinos. La BGLasa pura de Mrakia sp. LP 7.1.2016 fue capaz de aumentar ocho veces la cantidad de terpenos detectados en el vino mediante la técnica GC-MS. Se detectaron aumentos en los terpenos nerol, geraniol, y en los óxidos de trans y cis linalool. Por su parte, se evaluó la capacidad del extracto pectinolítico producido y las enzimas puras, así como también de otro extracto pectinolítico antártico, producido por la levadura Tausonia pullulans 8E, para extraer pectina a partir de pomaza de lima a 20 °C. Entre los extractos, sólo el producido por el T. pullulans fue útil para extraer pectina, mientras que ambas enzimas puras de Mrakia sp. LP 7.1.2016 también aumentaron la extracción. Los rendimientos utilizando las enzimas PGasaI y la PGasaII fueron entre 10 y 12 g de pectina por cada 100 g de pomaza inicial. Se trabajó con el extracto producido por T. pullulans 8E para evaluar el efecto de distintos parámetros en el rendimiento en pectina obtenido, como la temperatura, que no alteró significativamente los rendimientos entre 20 °C y 30 °C, y el tiempo de extracción, frente al cual sí se observaron diferencias al usar tiempos de 30 o 120 minutos. Las pectinas obtenidas con el extracto producido por T. pullulans 8E, con cerca de un 70% de esterificación, tuvieron 45% de ácidos urónicos, 50% de azúcares neutros, de los cuales muchos existieron de forma libre mientras que otros se encontraban covalentemente unidos a la molécula de pectina. Las pectinas obtenidas con las enzimas PGasaI y PGasaII, con grados de esterificación entre 73-80%, obtuvieron mayores contenidos de ácidos urónicos (65-85%) y menor de azúcares neutros (~30%). La pectina obtenida enzimáticamente con el extracto de T. pullulans 8E pudo utilizarse para formar geles con fibra, FOS y azúcares de bajas calorías. El extracto pectinolítico de Mrakia sp. LP 7.1.2016, por su parte, sí fue útil para macerar pitaya de pulpa roja y blanca a 23 °C, y aumentar el rendimiento de jugo de pitaya. Se lograron aumentos de 16% y 20% en los rendimientos de jugo de pitaya de pulpa roja y blanca, respectivamente. El color del jugo de pitaya roja se vio incrementado luego del tratamiento enzimático. También se evaluó la maceración de morrón, utilizando ambos extractos pectinolíticos y la PGasaI. A partir de la realización de un diseño experimental de Doehlert con las variables relación sólido-líquido (1:2-1:6), el tiempo de macerado (1-5 h) y el título total de poligalacturonasa (1-100 U), se determinó que las variables tiempo y título de enzima fueron significativas para explicar la variación del rendimiento de vegetal obtenido, mientras que la relación sólido-líquido no lo fue en el rango estudiado para ninguno de los dos extractos. Se lograron rendimientos de maceración cercanos al 90%. La enzima PGasaI (10 U) se logró un 24% más de maceración respecto del control sin enzima, luego de 6 horas. Utilizando las enzimas producidas por T. pullulans 8E y Mrakia sp. LP 7.1.2016 se extrajeron 2.8 y 0.7 veces más de actividad antioxidante por gramo de morrón, respectivamente, en comparación con el macerado sin enzimas. Los aumentos en polifenoles fueron de 0.9 y 0.2 veces, respectivamente. En cuanto a los azucares reductores, las diferencias fueron de 2.9 y 1.5 con las enzimas de T. pullulans 8E y Mrakia sp. LP 7.1.2016, respectivamente. Estos extractos podrían ser utilizados en distintos procesos en los cuales es necesario macerar vegetales, ya sea para preparar un puré vegetal licuado a bajas temperaturas o en algún proceso extractivo de compuestos vegetales de interés.