Biochemical and structural characterization of tomato polyphenol oxidases provide novel insights into their substrate specificity

Abstract

Polyphenol oxidases (PPOs) contain the structurally similar enzymes tyrosinases (TYRs) and catechol oxidases (COs). Two cDNAs encoding pro-PPOs from tomato (Solanum lycopersicum) were cloned and heterologously expressed in Escherichia coli. The two pro-PPOs (SlPPO1-2) differ remarkably in their activity as SlPPO1 reacts with the monophenols tyramine (kcat = 7.94 s−1) and phloretin (kcat = 2.42 s−1) and was thus characterized as TYR, whereas SlPPO2 accepts only diphenolic substrates like dopamine (kcat = 1.99 s−1) and caffeic acid (kcat = 20.33 s−1) rendering this enzyme a CO. This study, for the first time, characterizes a plant TYR and CO originating from the same organism. Moreover, X-ray structure analysis of the latent holo- and apo-SlPPO1 (PDB: 6HQI and 6HQJ) reveals an unprecedented high flexibility of the gatekeeper residue phenylalanine (Phe270). Docking studies showed that depending on its orientation the gatekeeper residue could either stabilize and correctly position incoming substrates or hinder their entrance into the active site. Furthermore, phloretin, a substrate of SIPPO1 (Km = 0.11 mM), is able to approach the active centre of SlPPO1 with both phenolic rings. Kinetic and structural results indicate that phloretin could act as a natural substrate and connote the participation of PPOs in flavonoid-biosynthesis.

Eine peptidvermittelte Selbstspaltungsreaktion initiiert die Tyrosinaseaktivierung

“…[1,2] PPOs treten in Archaeen, Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren auf. [7][8][9][10] Konkret werden pflanzliche PPOs als Proenzyme (55-65 kDa) exprimiert, die aus einer enzymatisch aktiven (40-45 kDa) und einer C-terminalen Domäne (15)(16)(17)(18)(19) bestehen. [7][8][9][10] Konkret werden pflanzliche PPOs als Proenzyme (55-65 kDa) exprimiert, die aus einer enzymatisch aktiven (40-45 kDa) und einer C-terminalen Domäne (15)(16)(17)(18)(19) bestehen.…”

“…[13] PPOs werden im Allgemeinen durch die Entfernung ihrer C-terminalen Domäne aktiviert. [12,15] Apfel-und Champignon-Tyrosinasen kçnnen in vitro durch die Verwendung gebräuchlicher Proteasen aktiviert werden, [16,17] jedoch wurde in beiden Fällen die C-terminale Domäne nicht spezifisch abgespalten, sondern von den jeweiligen Proteasen (Trypsin und Proteinase K) vollständig verdaut. [14] Es wird generell angenommen, dass pro-PPOs durch eine proteolytische Reaktion, auf die die Ablçsung der C-terminalen Domäne vom aktiven Protein folgt, aktiviert werden.…”

“…Der In-vivo-Aktivierungsmechanismus ist mit Ausnahme von drei Insekten-PPOs,d ie durch eine komplexe Kaskade von Serinproteinasen aktiviert werden, jedoch noch weitgehend unbekannt. [16][17][18] Es wird angenommen, dass das Detergens strukturelle Veränderungen innerhalb des Enzyms induziert, wodurch das aktive Zentrum fürankommende Substrate zugänglicher wird. [12,15] Apfel-und Champignon-Tyrosinasen kçnnen in vitro durch die Verwendung gebräuchlicher Proteasen aktiviert werden, [16,17] jedoch wurde in beiden Fällen die C-terminale Domäne nicht spezifisch abgespalten, sondern von den jeweiligen Proteasen (Trypsin und Proteinase K) vollständig verdaut.…”

“…[16,19] Während der anfänglichen Kristallisationsversuche mit pro-MdPPO1 wurden gut streuende Kristalle lediglich von der C-terminalen Domäne (C cleaved )e rhalten (1.35 Auflçsung,P DB-Eintrag 6ELT, Abbildung 1B). [16,19] Während der anfänglichen Kristallisationsversuche mit pro-MdPPO1 wurden gut streuende Kristalle lediglich von der C-terminalen Domäne (C cleaved )e rhalten (1.35 Auflçsung,P DB-Eintrag 6ELT, Abbildung 1B).…”

“…Die Kristallisation des kompletten pro-Enzyms war nur durch eine schnelle Prozessierung mçglich, d. h. die Kristallisation musste unmittelbar nach dem letzten Reinigungsschritt stattfinden, um eine Selbstspaltung des pro-Proteins weitestgehend zu vermeiden, was schließlich zur Rçntgenstruktur von pro-MdPPO1 führte (1.35 Auflçsung, PDB-Eintrag 6ELS,Abbildung 1A). [16] Die Schnittstelle wurde durch hochauflçsende Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) bestimmt, welche zeigte,d ass das Protein nicht nur an einer einzelnen Peptidbindung,s ondern innerhalb einer Sequenz von vier benachbarten Peptidbindungen (Ser 366-Ser 367-Ser 368-Lys369-Val 370, Abbildungen 2u nd S4) gespalten wird. Ein ähnlicher Prozess wurde kürzlich bei der PPO aus Aprikose beobachtet, bei der nach längerer Lagerung eine spontane Aktivierung beobachtet wurde.…”