Avaliação de dois métodos de extração de DNA de material parafinado para amplificação em PCR

Abstract

Apoio financeiro: Fundação para o Desenvolvimento da Unesp (Fundunesp) (00017/05).

Comparative study of DNA extraction methodologies from goat sperm and its effects on polymerase chain reaction analysis

“…However, it is clear that the use of the DNeasy Blood & Tissue Kit is limited by its high cost (Bailes et al, 2007), and extraction with phenol-chloroform is a laborious and potentially hazardous method (Sepp et al, 1994), where a significant amount of DNA can be lost (Goldenberger et al, 1995) and degraded (Hossain et al, 1997) and the PCR inhibited (Goldenberger et al, 1995). By contrast, Chelex-100 resin emerged as a cheap, effective, fast, and simple method, which can be realized in few steps, and does not require the use of organic solvents, which confirms observations of previous studies (Walsh et al, 1991;Simonato et al, 2007). The Chelex-100 method results in a low risk of sample contamination (Boom et al, 1990;Walsh et al, 1991;Simonato et al, 2007) and a lower hazard to the technician and the environment (Fernandes et al, 2004;Karthikeyan et al, 2010).…”

“…By contrast, Chelex-100 resin emerged as a cheap, effective, fast, and simple method, which can be realized in few steps, and does not require the use of organic solvents, which confirms observations of previous studies (Walsh et al, 1991;Simonato et al, 2007). The Chelex-100 method results in a low risk of sample contamination (Boom et al, 1990;Walsh et al, 1991;Simonato et al, 2007) and a lower hazard to the technician and the environment (Fernandes et al, 2004;Karthikeyan et al, 2010).…”

Diagnóstico molecular do granuloma lepróide canino, a partir de cortes histológicos emblocados em parafina, pela técnica de reação em cadeia de polimerase (Pcr) – estudo retrospectivo (2002-2009)

“…Contudo esse tipo de fixação resulta, habitualmente, no enovelamento de proteínas nucleares, na formação de ligações entre proteínas e DNA e, ainda, na fragmentação do mesmo, o que dificulta, sobremaneira, a extração dessa classe de moléculas de tecidos previamente fixados. Além disso, vários outros passos podem influenciar a obtenção de amplificações positivas, a começar pela forma de obtenção dos cortes e a desparafinização que, além de ser opcional, pode ser realizada através de calor ou lavagens com solventes, tal como o xilol; o tempo de digestão em proteinase K e a concentração desta última no tampão de digestão (SIMONATO et al, 2007). Hughes et al (2000) e Malik et al (2013) verificaram diferenças entre os resultados da PCR de DNA, extraído de amostras de tecido "a fresco" e de material oriundo de tecidos emblocados em parafina.…”

“…Resquícios de saliva, esfregaço de mucosa oral, sangue, bulbos capilares, tecidos emblocados em parafina, fragmentos ósseos, gotas de sêmen, dentre outros, propiciam informações importantes pois, rotineiramente, amostras de tecidos são removidas do corpo humano para análise, com vistas ao diagnóstico de doenças e os fragmentos oriundo desses materiais, fixados em formol, incluídos em parafina podem ser mantidos em laboratórios, uma vez que tais espécimens representam importante material biológico para investigação médico legal para fins de pesquisa acadêmica. Assim sendo, o aperfeiçoamento dos métodos de extração de DNA, a partir de tecido parafinado, de forma a torná-los de execução simples e de menor custo, facilita enormemente a utilização desses materiais em estudos retrospectivos, trazendo grande contribuição para a investigação da etiologia e da epidemiologia das enfermidades (JACKSON et al, 1990;SIMONATO et al, 2007).…”

Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular

“…Tecido com sangue deve ser lavado com salina antes de ser congelado (7) . Ocasionalmente, o teste molecular será solicitado apenas após o exame patológico, quando será realizado em tecido parafinado, sendo utilizados protocolos específicos nesses casos para desfazer o cross-linking e diminuir o efeito do cisalhamento dos ácidos nucleicos (11,12,30) . Para extração de RNA, a amostra deve ser congelada rapidamente em nitrogênio líquido antes de ser congelada a -70 o C (ou inferior), colocada em solução estabilizadora de RNA ou processada para extração de RNA em, no máximo, uma hora da coleta.…”