Automated enzymatic analysis of inulin

Abstract

We have developed an automated enzymatic assay for quantitation of inulin in plasma and urine that can be performed on the Cobas FARA II. In the assay, inulinase hydrolyzes inulin to fructose, and sorbitol dehydrogenase converts fructose to sorbitol with consumption of NADH, which is detected by spectrophotometry. The method incorporates a sample blank (inactivated inulinase) for each specimen to subtract contributions of endogenous fructose. Recovery of fructose or inulin was near 100%, with linearity to 300 mg/L. The enzymatic assay (y) agreed well with an anthrone comparison method (x) for analysis of inulin in both urine specimens (y = 1.00x - 138; Sy/x = 714) and plasma specimens (y = 1.00x - 3.5; Sy/x = 5.5). Glucose at 300 mg/L yielded an apparent inulin value of 1.3 mg/L in the enzymatic assay, but reacted at nearly 10% equivalency in the anthrone assay. Interferences from sorbitol, mannitol, and xylitol were negligible. CVs for day-to-day precision studies were 1-4%. The automated enzymatic assay of inulin is faster and avoids the use of caustic reagents required by the classical anthrone method.

Degradation of Fructans and Production of Propionic Acid by Bacteroides thetaiotaomicron are Enhanced by the Shortage of Amino Acids

“…Total levan content in culture broth was determined by hydrolysis and anthrone assay as follows. Briefly, samples were diluted and treated with 0.6 M HCl (final concentration) at 70°C for 2 h. Anthrone assay on hydrolyzed samples was performed according to Summerfield et al ( 38 ), except for the anthrone reactive which was prepared as follows: 100 mg anthrone and 2.5 mL absolute ethanol were dissolved in 50 mL 75% (vol%) sulfuric acid in water. The absorbance of samples was measured at 620 nm with a spectrophotometer (Helios Gamma, Thermo Electron Corporation, UK).…”

Measurement of inulin: development

“…Nous parlerons classiquement des méthodes de dosages dites « acide » et des méthodes dites « enzymatiques ». Pour les deux méthodes, la mesure d'un « blanc » est toujours conseillée d'une part, à cause des interférences possibles entre le dosage du fructose et du glucose (voir ci-dessous) et, d'autre part, pour prendre en compte le fructose « naturellement » présent dans le plasma [7]. Cependant, la concentration habituelle de fructose endogène dans le plasma est si faible (1 à 7 mg/L, données personnelles) qu'elle est négligée par certains auteurs [8,9].…”

“…C'est en 1952 que Young Jr l'adaptera pour la première fois au dosage de l'inuline [41]. C'est probablement la méthode « acide » qui est la plus utilisée de nos jours, du moins dans les pays anglo-saxons [7]. Young propose un traitement préalable du glucose de l'échantillon pour oxyder le glucose avec de l'hydroxyde de sodium [18].…”

“…Day ne précise pas la performance analytique de son dosage ni les éventuelles interférences avec le glucose [58]. La sorbitol déshydrogénase s'avérera néanmoins par la suite spécifique du fructose (réactivité avec le glucose inférieure à 1 %) [7,59]. Dalton, en 1987, propose une méthode « semienzymatique », à savoir une étape d'hydrolyse de l'inuline par l'acide perchlorhydrique (comme dans les méthodes « acide ») puis une étape enzymatique de dosage du fructose selon la proposition de Day.…”

“…Les auteurs insistent aussi sur le gain de temps obtenu par le fait que, contrairement aux méthodes « acide », une déprotéinisation préalable du plasma n'est plus nécessaire vu le pH moins acide de ces réactions [12]. En 1993, Summerfield [7] propose un dosage automatisé (sur Cobas FARA II) combinant l'utilisation de l'inulinase et l'enzyme sorbitol deshydrogénase reprenant ainsi, pour le dosage du fructose, la réaction enzymatique proposée antérieurement par Day (figure 2) [58]. L'article de Summerfield est intéressant car il compare directement sa méthode enzymatique avec une méthode « acide » [7], en l'occurrence, la méthode à l'anthrone [44].…”