Assessment of MDA efficiency for genotyping using cloned embryo biopsies

Abstract

The possibility to genotype embryos prior to implantation would have advantages for increasing the speed of selection of cattle. Reliable genotyping requires more DNA than can be obtained from biopsies of embryos, if they are to remain viable. Multiple displacement amplification (MDA) is a whole genome amplification technique used to increase the amount of DNA from biopsies for analysis. Reduced genome coverage resulting in Allele Drop Out (ADO) at heterozygous loci or missing genotypes are drawbacks of MDA. The present article describes the correlation between the input DNA quantity or embryo biopsy size and MDA success. Missing genotypes and ADO drastically increased when fewer than 30-40 cells or the genomic equivalents were used. However, embryo viability was found to be reduced if biopsied with more than 10 cells. Therefore, in vitro cell culture was investigated as a means to increase the number of cells available and the genotyping reliability.

Epigenetics and developmental programming of welfare and production traits in farm animals

“…The number of IVP embryos transferred has quadrupled over the past decade and now constitutes 40% of total embryos transferred in cattle. One driver for the current surge in interest in IVP embryos is the prospect of genomic selection of Day 7 embryos (Lauri et al 2013). This can significantly reduce the breeding interval (and so increase response to selection) by virtue of the fact that selection occurs at Day 7 of gestation and not at term.…”

Single-cell analyses of transcriptional heterogeneity during drug tolerance transition in cancer cells by RNA sequencing

“…The coupling of whole genome amplification and DNA sequencing have allowed multiple groups to study the genetics of single cells, but not without significant amplification biases (9)(10)(11). Moreover, single-cell exome sequencing confirmed the clonal heterogeneity of a solid tumor identifying key mutations across much of the genome (12).…”

Diagnóstico genético pré-implantacional de embriões bovinos utilizando plataformas de genotipagem de marcadores moleculares do tipo SNP

“…As taxas de ADO, na mesma ordem dos grupos, foram de 5,83%, 2,52% e 0,03%. Conforme descrito na tabela 8, esses resultados são semelhantes aos reportados por Lauri et al (2013). Sargolzaei et al (2013) Os resultados desse estudo demonstram claramente que, apesar de ser possível a realização da genotipagem a partir de células embrionárias, a quantidade de células obtidas na biópsia influencia diretamente a qualidade da genotipagem.…”

“…Entretanto, a taxa de mortalidade embrionária é diretamente proporcional à quantidade de células obtidas no processo de micromanipulação (ALONSO, 2008;LAURI et al, 2013), ou seja, quanto maior o número de células biopsiadas, menor a chance de sobrevivência do embrião. Dessa forma, a micromanipulação de embriões em estádios de desenvolvimento mais avançados (Bl e Bx) pode ser mais recomendada do que embriões nos estádios de Mo e Bi, possibilitando a obtenção de maior número de células com menores prejuízos ao embrião.…”

“…A bovinocultura de corte representa a maior fatia do agronegócio brasileiro, gerando faturamento de mais de R$50 bilhões/ano e oferecendo cerca de 7,5 milhões de empregos, colocando o país como um dos maiores exportadores de carne bovina nos últimos anos (ABIEC, 2011 (WU et al, 2005;MIZOGUCHI et al, 2006;IMAI et al, 2007;TAKASUGA et al, 2007;ABE et al, 2008;GUTIÉRREZ-GIL et al, 2008;JIANG et al, 2009 A primeira e fundamental etapa para realização do PGD é a realização de uma técnica de micromanipulação embrionária, que permita a obtenção de células embrionárias sem prejudicar a viabilidade do embrião após a biópsia (PONSART et al, 2012). Em humanos, a maioria dos trabalhos descreve a realização da biópsia no estádio de 8-16 blastômeros, com a retirada de um único blastômero para realização das análises genéticas (ALMODIN et al, 1999 como um método revolucionário no PGD tanto na área animal como humana (BARKER et al, 2004;HANDYSIDE et al, 2004;HOLBROOK et al, 2005;SPITS et al, 2006;ALONSO et al, 2007;COSKUN;ALSMAD, 2007;ALONSO et al, 2008;HUMBLOT et al, 2010;LE BOURTHIS, et al, 2010POLISSENI et al, 2010;CHEN et al, 2011;TREFF et al, 2011;PONSART et al, 2012;ZHENG;WANG;JIN, 2011;HAN et al, 2012;LAURI et al, 2013;SARGOLZAEI et al, 2013 Apesar das diversas aplicações demonstradas, a metodologia de PEP apresenta algumas desvantagens, como a pequena quantidade de produto amplificado que varia de 10 2 a 10 4 (PAUNIO et al, 1996) e a produção de fragmentos menores do que 1.500 pares de bases (WELLS et al, 1999), o que tem limitado a sua aplicação no diagnóstico genético pré-implantacional.…”