Application of the SPR Biosensor in Drug Prototypes Discovery with Human Cytochrome P450(51) as an Example

Abstract

The development of the integral platform “From Gene to Lead”, consolidated computer methods, bioinformatics researches, and experimental approaches, significantly accelerated and optimized base structure search in the field of drug design. The necessity of the experimental verification of hundreds virtual structure hypothesis (results of molecular data base selections or de novo construction) requires demands the usage of the high-through out and sensitive methods for validation possible interaction between numerous of selected compounds and particular molecular targets and evaluation of affinity, kinetics and thermodynamics. Surface plasmon resonance (SPR) technology makes it possible to solve all these problems. In this article the methodical aspects of the optical SPR-biosensor usage in the field of drug prototypes selection are described using the human cytochrome P450(51) catalyzing one of the key step of cholesterol biosynthesis as an example.

SPR Biosensor Based High-Throughput Screening of Low Molecular Weight Compounds for Interaction with Candida krusei CYP51

“…SPR анализ был выполнен с применением оптического биосенсора Biacore 8K ("Cytiva", США) аналогично процедуре, описание которой приведено в [8]. В работе были использованы стандартные оптические чипы типа СМ5 ("Cytiva", США), поверхность которых покрыта карбоксиметилированным декстраном.…”

Biosensor selection of small compounds, modulating a complex formation between cytochrome P450s and NADPH-dependent P450 oxidoreductase

“…В ходе иммобилизации были последовательно выполнены следующие процедуры: (а) инжекция смеси равных объемов 0.2 M EDC и 0.05 M NHS в течение 7 мин при скорости потока 5 мкл/мин; (б) инжекция 25 мкг/мл раствора белка в иммобилизационном буфере в течение 10 мин при скорости потока 5 мкл/мин; (в) промывка каналов биосенсора рабочим буфером HBS-ЕР+ в течение 1 ч при скорости потока 25 мкл/мин. Анализируемые образцы, содержащие NADPH в концентрациях от 1 мкМ до 200 мкМ, были приготовлены в HBS-ЕР+ буфере [8] Подготовка образцов низкомолекулярных соединений для скрининга связывающей способности с иммобилизованными белками описана в работе [14]. Навески тестируемых НС, которые не растворимы в рабочем буфере, растворяют либо в 96%-ном этиловом спирте, либо в одном из органических растворителей, например, диметилсульфооксиде.…”

“…Этот шаг требуется для исключения крайне нежелательного резкого перепада сигналов биосенсора (bulk-effect) при последовательной инжекции двух растворов с сильно отличающимися коэффициентами преломления. Одна из таких методик с использованием лабораторного рефрактометра представлена в работе [14]. Для биосенсорного анализа содержание растворителя в буфере не должно превышать 3% по объему, поскольку при более высоких концентрациях растворителя появляются приборные артефакты измерений, а также снижается конформационная стабильность белковой молекулы.…”