Apoptotic endonuclease EndoG regulates alternative splicing of human telomerase catalytic subunit hTERT

Abstract

2 Российский университет дружбы народов, экологический факультет, Москва 3 Институт теоретической и экспериментальной биофизики, Пущино Каталитическая субъединица теломеразы человека hTERT подвергается альтернативному сплайсингу, что приводит к потере её функций и снижению теломеразной активности. Известно, что в альтернативном сплайсинге мРНК hTERT принимает участие апоптотическая эндонуклеаза EndoG. Нами изучена роль EndoG в регуляции альтернативного сплайсинга мРНК hTERT. Показано, что сверхэкспрессия EndoG в клетках карциномы кишечника CaCo-2, а также обработка клеточных ядер и цитоплазмы рекомбинантной EndoG и инкубация ядер с РНК, расщепленной рекомбинантной EndoG, приводит к повышению уровня варианта с b-делецией. В изолированных клеточных ядрах и трансфицированных клетках альтернативный сплайсинг мРНК hTERT индуцировался 47-членным РНК-олигонуклеотидом. Идентифицирована длинная некодирующая РНК (1157 нуклеотидов), из которой образуется активный 47-членный РНК-олигонуклеотид. Предложен следующий механизм сплайсинга мРНК hTERT: c кодирующей цепи гена hTERT синтезируется пре-мРНК, а с матричной -длинная некодирующая РНК; EndoG вырезает из длинной некодирующей РНК 47-членный олигонуклеотид, комплементарный пре-мРНК hTERT, в месте соединения экзона 8 и интрона 8. Взаимодействие этого олигонуклеотида с пре-мРНК hTERT индуцирует альтернативный сплайсинг.Ключевые слова: EndoG, теломераза, hTERT, альтернативный сплайсинг, CaCo-2 DOI 10.18097/PBMC20166205544 * -адресат для переписки клеток плазмидой pEndoG-GFP или контрольной плазмидой pGFP (обе "InvivoGen", США) проводили с использованием Lipofectamine 2000 ("Invitrogen", США) по протоколу компании производителя. Эффективность трансфекции (обычно 90-100%) оценивали, подсчитывая число GFP-положительных клеток с использованием флуоресцентной микроскопии. Для трансфекции клеток 47-членным РНК-олигонуклеотидом EGPO (EndoG-produced oligonucleotide) или контрольной РНК (табл. 1, "Синтол", Россия) использовали Oligofectamine Reagent ("Invitrogen") по протоколу компании производителя. Для защиты от нуклеаз EGPO и контрольную РНК модифицировали основаниями с фосфоротиоатными связями. Выделение клеточных органелл и обработка рекомбинантной EndoG (recEndoG)Цитоплазму клеток получали согласно [13]. Клетки гомогенизировали на льду при помощи роторного гомогенизатора Ultra-Turrax T25 ("IKA", США) в 300 мкл буфера: 10 мМ HEPES ("Sigma", США), 10 мМ KCl ("Sigma"), 1,5 мM MgCl 2 ("Sigma"), 0,1 мM EGTA ("Sigma"), 0,3% NP-40, ингибитор протеаз (Protease Inhibitor Cocktail Tablets Complete, Mini, "Roche", Швейцария), pH 7,4, и центрифугировали в течение 3 мин при 2000 g и 4°С. Супернатант содержал фракцию цитоплазмы. Клеточные ядра выделяли согласно [14]. Клетки гомогенизировали на льду при помощи роторного гомогенизатора в 300 мкл раствора, содержащего 50 мМ Трис-HCl pH 7,9, 0,25 М сахарозу, 10 мМ CaCl 2 , и центрифугировали (ультрацентрифуга Optima XE, "Beckman Coulter", США) при 70000 g в течение 90 мин в среде, содержащей 2 М сахарозу, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ CaCl 2 , 5 мМ b-мерка...

Inhibition of telomerase activity and induction of apoptosis by Rhodospirillum rubrum L‐asparaginase in cancer Jurkat cell line and normal human CD4+ T lymphocytes

“…Telomerase activity was determined using (TRAP) Telomeric Repeat Amplification Protocol [2,26]. Cells were lysed in 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1 mmol/L MgCl 2, 1 mmol/L EGTA, 0.1 mmol/L PMSF, 5 mmol/L 2-Mercaptoethanol, 0.5% CHAPS и 10% glycerol (all from Sigma-Aldrich) and centrifuged 30 min at 12,000g.…”

Suppression of telomerase activity leukemic cells by mutant forms of Rhodospirillum rubrum L-asparaginase

“…Активность теломеразы определяли методом TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) по методике, описанной нами ранее [28][29][30]. Результаты TRAP оценивали в программе GelAnalyzer 2010а.…”

The influence of chorionic gonadotropin on phenotype conversion and hTERT gene expression by T-lymphocytes of different degrees of differentiation

“…Основная роль ИЛ-2 заключается в обеспечении перехода антиген-примированных Т-лимфоцитов из G1 в S-фазу Раев и др. [20]. Можно предположить, что в наших экспериментах существует определённый фоновый уровень экспрессии сплайс-формы hTERT в пуле апоптотических клеток, но ХГ, по-видимому, не участвует в регуляции этого процесса.…”