Análise do padrão de expressão de BhC4-1-GFP em linhagens transgênicas de Drosophila melanogaster

Abstract

Nosso laboratório investiga os mecanismos moleculares que promovem o estabelecimento de padrões de expressão gênica regulados no desenvolvimento em eucariotos superiores. Como modelo, utilizamos o gene de pufe de DNA BhC4-1, que é amplificado e expresso de modo regulado na glândula salivar e na glândula protorácica no final do quarto estadio larval de B. hygida. Estudos funcionais em D. melanogaster resultaram na identificação de módulos cis-reguladores (MCRs) na região promotora do gene BhC4-1. O MCR de glândula anelar de 67 bp (-253/-187), promove a expressão de BhC4-1-lacZ na glândula anelar a partir do final do desenvolvimento embrionário. O MCR de glândula salivar de 129 bp (-186/-58), dirige a expressão do transgene nas glândulas salivares de prépupas. A glândula anelar é o principal órgão endócrino larval e em D. melanogaster é o resultado da fusão das glândulas protorácicas (responsáveis pela síntese de hormônios esteroides), corpus allatum (síntese de hormônio juvenil) e corpus cardiacum (glândula neuroendócrina). Neste trabalho foram obtidas 12 linhagens independentes transformadas com uma construção que contém o fragmento (-253/+40) do promotor do gene de pufe de DNA BhC4-1 clonado à montante do gene repórter GFP. O genótipo destas linhagens foi validado utilizando-se Southern blots. Inicialmente as 12 linhagens obtidas foram analisadas quanto ao padrão de expressão de GFP em larvas de terceiro estadio e em prépupas 2 horas. Em conjunto, esta análise revelou que o padrão de expressão de GFP é bastante variável nestas linhagens. A análise do padrão de expressão da proteína repórter foi estendida em duas linhagens representativas da série (-253/+40)/GFP. Nestas linhagens a expressão de GFP é inicialmente detectada na glândula salivar durante o estágio de prépupa e na glândula anelar a partir do terceiro estadio larval. Diferentemente do anteriormente observado em linhagens (-253/+40)/lacZ, nestas linhagens não detectamos a expressão de GFP em tempos do desenvolvimento anteriores ao terceiro estadio larval. Experimentos de interação gênica revelaram que na ausência do fator de transcrição br, a expressão de GFP é mantida na glândula anelar e abolida na glândula salivar de larvas de terceiro estadio. Os resultados dos experimentos de interação gênica corroboram dados anteriores que indicavam que o conjunto de fatores de transcrição que regulam a expressão de BhC4-1-lacZ na glândula anelar é distinto daquele que promove a expressão do gene na glândula salivar. As linhagens obtidas neste trabalho constituem uma ferramenta a ser utilizada na caracterização de fatores de transcrição tecido-específicos que regulam o gene BhC4-1 na glândula anelar e/ou na glândula salivar a partir do final do desenvolvimento larval.