An improved system for estradiol-dependent regulation of gene expression in yeast

Abstract

Background: Saccharomyces cerevisiae is widely utilized in basic research as a model eukaryotic organism and in biotechnology as a host for heterologous protein production. Both activities demand the use of highly regulated systems, able to provide accurate control of gene expression in functional analysis, and timely recombinant protein synthesis during fermentative production. The tightly regulated GAL1-10 promoter is commonly used. However, induction of the GAL system requires the presence of the rather expensive inducer galactose and the absence of glucose in the culture media. An alternative to regulate transcription driven by GAL promoters, free of general metabolic changes, is the incorporation of the hybrid Gal4-ER-VP16 protein developed by D. Picard. This chimeric protein provides galactose-independent activation of transcription from GAL promoters in response to β-estradiol, even in the presence of glucose. However, constitutive expression of this transactivator results in relatively high basal activity of the GAL promoters, therefore limiting the gene expression capacity that is required for a number of applications.

Systems for applied gene control in Saccharomyces cerevisiae

“…In the absence of ß-estradiol, glucose represses transcription of the transactivator-encoding gene, allowing the basal expression level of this system to be as low as that of native GAL genes in glucose-containing media. In contrast, when ß-estradiol is added to standard batch cultures, a 250-fold induction of the regulated gene is achieved (Quintero et al 2007). The dynamic range is therefore eight times higher in this system than in the previous configuration (Table 1).…”

Sistema de expressão induzido por estradiol em <i>Saccharomyces cerevisiae</i>.

“…A regulação dirigida por esse tipo de indutor envolve a presença de um fator de transcrição quimérico constituído por um domínio de ligação ao DNA, um domínio de ativação e um domínio de ligação hormonal (QUINTERO et al, 2007). Esse sistema permite a indução com estradiol da proteína recombinante de interesse.…”

“…Sendo elas, as sequências do fator de transcrição quimérico (LOUVION; HAVAUX-COPF; PICARD, 1993;LYTTLE et al, 1992;NALLEY;JOHNSTON;KODADEK, 2006;QUINTERO et al, 2007;TANAKA et al, 1989) para reconhecimento do indutor estrogênio e a sequência do promotor quimérico cbh1 do T. reesei (CARRARO et al, 1998;HENRIQUE-SILVA et al, 1996;NEVALAINEN;TE'O;BERQQUIST, 2005). PICARD, 1993;TANAKA et al, 1989).…”

“…Amplificação do DNA do plasmídeo regulador (linha 1) e DNA genômico de S. cerevisiae W303-1A transformada com o plasmídeo regulador e de expressão (linha 2) com os oligonucleotídeos synth2-852F e synth3-1538R, produto de PCR de ~0.7 kb; Amplificação do plasmídeo regulador (linha 3) e DNA genômico de S. cerevisiae W303-1A transformada com o plasmídeo regulador e de expressão (linha 4) com os oligonucleotídeos synth2-852F e synth3-2128R, produto de PCR de ~1.3 kb e PM: Peso Molecular 1 Kb ladder (Life Technologies, USA). ENGELBERG, 2012), produção de proteínas recombinantes (SAMPAIO et al, 2008) e sistemas de expressão induzidos por estrogênio (QUINTERO et al, 2007) Posteriormente, foi realizada a amplificação com os oligonucleotídeos específicos para confirmação da integração dos plasmídeos. As amplificações realizadas do DNA genômico podem ser observadas na figura 13 para o plasmídeo regulador e na figura 14 para o plasmídeo de expressão.…”

“…Alguns trabalhos (LYTTLE et al, 1992;QUINTERO et al, 2007) Figura 29. Determinação da atividade enzimática de cbh1.O transformante 2 foi submetido à indução no meio YP Sacarose 2% sob diferentes concentrações de DES e E2 (zero, 5µM e 10µM).A análise da atividade da celobiohidrolase I foi feita pelo teste de DNS nos intervalos de tempo de 6, 12 e 24 horas, cujo resultado é apresentado no gráfico em µg/mL.…”