An Improved Procedure for the Preparation of Thrombin Low Molecular Weight Substrates - Peptide p-Nitroanilides

Abstract

ВВЕДЕНИЕХромогенные субстраты ферментов часто используются для определения активностей последних с помощью фотометрических методов [1,2]. Так как данные методы широко применяются в научных исследованиях, клинической диагностике, при проведении анализов в биотехнологической промышленности, экологии и иных областях для выявления ферментов и оценки их активности, потребности в специфичных хромогенных субстратах весьма высоки, и многие из этих субстратов есть в каталогах зарубежных компаний -производителей и поставщиков реактивов.Тромбин, он же фактор свёртывания II, играет одну из ключевых ролей в процессе свёртывания крови. Нарушения процесса свёртывания, вызывающие усиленную активацию тромбина, приводят к тромбозам и являются одними из основных причин развития сердечно-сосудистых заболеваний, нарушения кровообращения и кровоснабжения органов и тканей [3][4][5]. Связь серьезных патологий с нарушением регуляции активности тромбина требует контроля активности этого фермента. Медикаментозная регуляция повышенной свёртываемости крови также должна сопровождаться контролем активности тромбина, поскольку длительное и излишнее снижение её может привести к опасным для жизни кровотечениям [5]. Помимо этого, разработка новых лекарственных средств, регулирующих активность тромбина, сопровождается исследованием их воздействия на кинетические параметры катализируемых тромбином реакций. Потребность в субстратах тромбина, позволяющих просто, надежно и в условиях прямой регистрации во времени определять активность этого фермента, привела к разработке ряда коротких пептидов, модифицированных по С-концевой карбоксильной группе остатками хромофора (п-нитроанилина) или флуорофора (7-амино-4-метилкумарина) [6,7]. п-Нитроанилидные субстраты ранее получали путём присоединения хромофора непосредственно к готовому пептиду либо к С-концевой аминокислоте в растворе [2,[8][9][10], однако разработаны и более удобные так называемые one-pot способы синтеза п-нитроанилидов пептидов на твёрдой фазе. В ряде способов аминокислотный остаток присоединяется к смоле за функциональную группу в боковой цепи [9][10][11]. Это требует обязательного наличия таких остатков вблизи С-конца пептида и использования особым образом функционализированных смол, обычно не применяемых в пептидном синтезе [11,12], что весьма неудобно и непрактично. Использование связанного со смолой п-фенилендиамина позволило проводить наращивание на нём пептидной цепи с помощью стандартных методик твердофазного пептидного синтеза с последующим окислением остатка п-аминоанилида (рАА) до п-нитроанилида (pNA) в отщепленных пептидах, однако применяемые смолы подвергались дополнительным модификациям для обеспечения возможности присоединения п-фенилендиамина [13,14]. Наиболее удобным оказался способ с модификацией остатком п-фенилендиамина смолы с легко замещаемым атомом хлора (тритилхлоридной или 2-хлортритилхлоридной, обычно используемых для синтеза защищенных пептидов) с последующим наращиванием на нём пептидной цепи с помощью Fmoc-аминокислот и мягким окислением остатка п-аминоанилида до п...

Influence of amino acid and N-terminal protection residue structures on peptide p-nitroanilide adsorption on polystyrene-based support

“…However, the similarity of chemical structures of Bio-Beads® SM-2 and Porapak Q (employed for the separation of Phe-containing peptides via their adsorption from water solutions (Vogel and Altstein, 1977)) and the adsorption of Triton X100 on Bio-Beads® SM-2 (Horigome & Sugano, 1983;Varhac et al, 2009) point out to the ability of Bio-Beads® SM-2 of adsorbing phenyl groupcontaining peptides and hence separating them from other molecules. Our previous successful separation of N-α-benzoyl-peptide-pNAs from Oxone® using Bio-Beads® SM-2 con rms this hypothesis (Chistov et al, 2018). Since the hydrophobicity of the benzoyl moiety makes the corresponding substrates less water-soluble than their analogues with N-terminal protecting groups such as tosyl (Tos, p-toluene sulfonyl), glutaryl (glut) and even carbobenzoxy (Z), the latter ones are preferable to benzoyl for the use in peptide enzyme substrates.…”

“…As for Tos, both its polar and voluminous sulpho-group and methyl residue may in uence (via spatial hindrances) the adsorption e cacy. To be suitable for the oxidizer removal via adsorption on Bio-Beads® SM-2, a peptide-pNA prepared from the corresponding peptide-pAA should contain either Phe residue or Z or benzoyl (Chistov et al, 2018) N-terminal protection.…”

“…Acetonitrile of LC-MS and HPLC grades was from BioSolve BV (Valkenswaard, Netherlands). Bio-Beads® SM-2 was a product of Bio-Rad Laboratories (USA) Peptide-pNA preparation pAA-modi ed resin was obtained by p-phenylene diamine attachment to Trityl chloride resin as described earlier (Abbenante et al, 2000;Chistov et al, 2018). Peptide-pAAs were prepared manually from Fmocsubstituted amino acids using amino acid carboxy-group activation with HBTU/Oxyma Pure in the presence of simm-collidine.…”

“…Substrate oxidation was performed as described earlier (Abbenante et al 2000;Chistov et al, 2018). The peptide-pAAs were dissolved in a water-acetonitrile mixture from 5-80% CH 3 CN (v/v) depending on the peptide solubility.…”

“…Moreover, this procedure is not suitable for a multiple parallel format. Recently we developed the puri cation procedure for peptide-pNAs from Oxone® via the adsorption onto Bio-Beads® SM-2 (Chistov et al, 2018). This polystyrene-based support can be either packed into columns with a rapid ow-through or used in a batch-wise procedure due to a rather large bead size; hence, it is well suited for a multiple parallel procedure development.…”