An <i>S</i>‐Selective Lipase Was Created by Rational Redesign and the Enantioselectivity Increased with Temperature

Magnusson, Anders O.; Takwa, Mohamad; Hamberg, Anders; Hult, Karl

doi:10.1002/anie.200500971

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“…[26][27][28] This enzyme was readily bound to EziG™ within 30 min of incubation while ten days of incubation was required for immobilization on Accurel®. For this variant, EziG™ (HybCPG VBC) is a more suitable carrier than Accurel® based on the bulk volumetric activity and the time needed for immobilization (see Table S2, Supplementary Information).…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

A general protein purification and immobilization method on controlled porosity glass: biocatalytic applications

et al. 2014

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Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

A general protein purification and immobilization method on controlled porosity glass: biocatalytic applications

et al. 2014

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“…In enzymecatalysed reactions, increasing temperature generally decreases selectivity. [52][53][54][55][56][57][58][59][60][61][62] In a few studies, however, enhanced selectivity with increasing temperature, 63,64 or a maximum of enantioselectivity at a certain temperature, 38,65 or even indifference to temperature was found. 66 In most of the quoted examples, the enzyme-catalysed reactions were carried out in batch mode (in stirred or shaken flasks) and only a few studies on the temperature effects on lipase-catalysed KRs were performed in continuous-flow mode so far.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Lipase-Catalyzed Kinetic Resolution of 1-(2-Hydroxycyclohexyl)Indoles in Batch and Continuous-Flow Systems

et al. 2014

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The lipase catalysed kinetic resolution of three trans-1-(2-hydroxycyclohexyl)-indoles in both batch and continuous-flow systems is reported. Ring opening of cyclohexene oxide by the corresponding indole followed by enzymatic acylation with vinyl acetate resulted in novel, highly enantioenriched indole-substituted cyclohexanols and cyclohexyl acetates. The effect of the temperature on enantiomeric ratio (E) and productivity (specific reaction rate, r flow ) in the continuous-flow mode acylation was studied at analytical scale in the 0-70°C range.Preparative scale kinetic resolution of the three indole derivatives was performed in mixed continuous-and recirculation-flow mode resulting in almost complete conversion and good to excellent enantiomeric purity of the products.

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“…Oft ließ sich die Enantioselektivität durch diese Methoden steigern, eine Umkehrung der Enantioselektivität gelang aber nur in Ausnahmefällen. [2] Interessant für die Synthese sind nur E-Werte > 50 -eine Schwelle, die nur schwer zu überwinden ist, wenn man von einem Enzym mit entgegengesetzter Enantioselektivität ausgeht. Beispielsweise änderten May et al eine d-selektive Hydantoinase in eine l-selektive Variante, mit der allerdings nur 20 % ee erreicht werden konnten, [2d] und Zha et al…”

unclassified

Vollständige Umkehrung der Enantioselektivität gegen acetylierte tertiäre Alkohole durch eine Doppelmutation in einer Esterase aus Bacillus subtilis

2008

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Zur Synthese enantiomerenreiner Verbindungen werden häufig Biokatalysatoren eingesetzt, da diese wegen ihrer hohen Chemo-, Regio-und Stereoselektivität der chemischen Katalyse oft überlegen sind; [1] allerdings zeigen die Wildtypen (WTs) der Enzyme oft keine breite Substratspezifität in Kombination mit einer ausreichend hohen Selektivität. Diese Einschränkungen können durch rationales Proteindesign oder gerichtete Evolution beseitigt werden. Oft ließ sich die Enantioselektivität durch diese Methoden steigern, eine Umkehrung der Enantioselektivität gelang aber nur in Ausnahmefällen.[2] Interessant für die Synthese sind nur E-Werte > 50 -eine Schwelle, die nur schwer zu überwinden ist, wenn man von einem Enzym mit entgegengesetzter Enantioselektivität ausgeht. Beispielsweise änderten May et al. eine d-selektive Hydantoinase in eine l-selektive Variante, mit der allerdings nur 20 % ee erreicht werden konnten, [2d] und Zha et al.[2e] invertierten die Enantioselektivität einer Lipase aus Ps. aeruginosa bis zu E = 30. Zudem können die Varianten deutlich an katalytischer Aktivität einbüßen, wie dies für eine Arylmalonat-Decarboxylase mit invertierter Enantioselektivität beschrieben wurde.[3] Daher zählt die Umkehrung der Enantiopräferenz immer noch zu den anspruchsvollsten Aufgaben des Proteindesigns.Eine Esterase von Bacillus subtilis (BS2) wurde den GGG(A)X-Hydrolasen zugeordnet [4] und zeigt dementsprechend Aktivität gegenüber Estern tertiärer Alkohole. Esterasen, die das häufigere GX-Motiv in der Oxyaniontasche enthalten, sind hingegen wegen ihres kleineren aktiven Zentrums nicht gegen diese sterisch recht anspruchsvollen Ester aktiv. Mit den Mutanten G105A und E188D wurden zwei Varianten mit exzellenter R-Enantioselektivität (E > 100) gegen den Ester 1 hergestellt, während der Wildtyp eine Enantioselektivität von E R = 42 aufweist.[5] Optisch aktive tertiäre Alkohole sind wichtige Bausteine für die organische Synthese [6] und wurden kürzlich zur Herstellung eines oral aktiven A 2A -Rezeptorantagonisten in einem Maus-Katalepsiemodell verwendet.[7] Darüber hinaus sind fluorierte optisch aktive Alkohole von großem Interesse, da sie in ferroelektrischen Flüssigkristallen und Wirkstoffen Verwendung finden können. [8] Auf der Basis einer vorangegangenen Studie zum rationalen Proteindesign [5a] berichten wir hier über die Strategie einer fokussierten gerichteten Evolution zur Inversion der Enantioselektivität der Esterase BS2 gegen acetylierte tertiäre Alkohole (Schema 1).Durch Computer-Modeling identifizierten wir kürzlich [5a] den Rest E188, der einen starken Einfluss auf die Enantioselektivität der Esterase BS2 gegen acetylierte tertiäre Alkohole ausübt: Während die Mutante E188D einen E-Wert von E R > 100 für 1 aufwies, zeigte die Mutante E188F eine umgekehrte Enantiopräferenz (E S = 3). Diese Beobachtung veranlasste uns, eine fokussierte gerichtete Evolution, basierend auf Sättigungsmutagenese in Anlehnung an die von Reetz und Mitarbeitern entwickelte CASTing-Methode, [9] durchzuführen. Anhand der Kristallstrukt...

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An S‐Selective Lipase Was Created by Rational Redesign and the Enantioselectivity Increased with Temperature

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A general protein purification and immobilization method on controlled porosity glass: biocatalytic applications

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Vollständige Umkehrung der Enantioselektivität gegen acetylierte tertiäre Alkohole durch eine Doppelmutation in einer Esterase aus Bacillus subtilis

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