Affinity chromatography as a tool for antibody purification

Ayyar, B. Vijayalakshmi; Arora, Sushrut; Murphy, Caroline; O’Kennedy, Richard

doi:10.1016/j.ymeth.2011.10.007

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“…7 Apart from naturally occurring antibody formats, combinatorial deoxyribonucleic acid (DNA) technology has facilitated the development of recombinant antibodies such as fragment variable (Fv), disulfide-stabilized Fv antibody fragment, single-chain fragment variable (scFv), fragment antigenbinding (Fab), single-chain antibody fragment, divalent antibody formats such as minibody, diabody, F(ab′) 2 and (scFv) 2 , and multivalent forms such as tetrabodies, triomabs, triabodies, and F(ab) 3 . 8,9 Overview of conventional methods Selective antibody purification is commonly carried out using affinity chromatography or affinity-tag-based chromatography. It achieves high selectivity and purity; however, it becomes costly when utilized on a large-scale.…”

Section: Antibodies Come In Many Shapes and Sizesmentioning

confidence: 99%

“…They are often the method of choice for antibody processing and more specifically, affinity-based methods are routinely used in the biopharmaceutical industry owing to the high selectivity and purity that can be achieved to meet regulatory and quality-control standards. 9 Innovations to improve the traditional methods such as biological-ligand-based methods are consistently investigated, while the use of complementary chromatographic techniques are now starting to achieve purities to match affinity-based techniques.…”

Section: Advances In Chromatography-based Purification Technologiesmentioning

confidence: 99%

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Technology advancements in antibody purification

Murphy¹,

Devine²,

O’Kennedy³

2016

ANTI

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Abstract:The separation of antibodies from complex mixtures can be achieved using chromatographic or non-chromatographic techniques. The purification of antibodies using chromatography involves the separation of antibodies or antibody-derived molecules present in complex mixtures by passing them through a solid phase (eg, silica resin or beads, monolithic columns, or cellulose membranes) and allowing the antibodies to bind or pass through depending on whether "bind-and-elute" or "flow-through" chromatographic methods are employed. Chromatographic methodologies can incorporate different separation techniques, such as affinity-tag binding, ion-exchange, size-exclusion chromatography, or immunoaffinity chromatography. However, in a concerted effort to become less reliant on chromatography-based separations owing to the high cost of large-scale production, non-chromatographic-based techniques such as precipitation, flocculation, crystallization, filtration, and aqueous two-phase partitioning are now becoming more popular. This review details current chromatographic and non-chromatographic methodo logies used for the purification of antibodies and expands on technological advancements and practical uses that have recently been reported.

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Section: Antibodies Come In Many Shapes and Sizesmentioning

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Section: Advances In Chromatography-based Purification Technologiesmentioning

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Technology advancements in antibody purification

Murphy¹,

Devine²,

O’Kennedy³

2016

ANTI

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“…Tradicionalmente, a purificação dessas biomoléculas é realizada por meio da técnica de cromatografia de afinidade, empregando como ligantes a proteína A ou a proteína G imobilizadas (Huse et al, 2002). No entanto, esses ligantes apresentam algumas desvantagens, tais como o elevado custo, o risco de desnaturação do anticorpo e de desprendimento do ligante da matriz em decorrência das condições de eluição a baixos valores de pH e o risco da inativação do ligante após sucessivos ciclos de purificação (Ayyar et al, 2012). Diante desses inconvenientes, estudos têm sido desenvolvidos visando o emprego de técnicas alternativas à cromatografia de afinidade (Coleman e Mahler, 2003; Yu e Ghosh, 2010) ou de ligantes substitutos das proteínas A e G (Khoury e Lowe, Área temática: Processos Biotecnológicos 1…”

Section: Nos úLtimos Anos Vários Fragmentos De Igg Foram Aprovados Punclassified

PURIFICAÇÃO DE FRAGMENTOS Fab POR IMAC EM AGAROSE-CM-Asp-Co(II)

Mourão¹,

Bueno²

2015

Anais Do XX Congresso Brasileiro De Engenharia Química

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RESUMO -As imunoglobulinas G (IgG) e seus fragmentos Fab, F(ab)' 2 e Fv apresentam aplicações relevantes na área médica e de diagnóstico. O elevado custo de purificação dessas biomoléculas por técnicas de afinidade justifica a investigação de alternativas de baixo custo para a sua purificação. O objetivo deste trabalho é avaliar a eficácia do quelato CM-Asp-Co(II) imobilizado em agarose na purificação dos fragmentos Fab de IgG humana, a partir de uma solução de IgG clivada pela enzima papaína. O efeito do sistema tamponante e do cloreto de sódio foram avaliados. O tampão Hepes na ausência de sal, permitiu obter os fragmentos Fab com pureza superior a 90%. Esse tampão possibilitou a maior recuperação seletiva dos fragmentos, em comparação com o tampão Hepes contendo NaCl e com os tampões, Tris-HCl e fosfato de sódio. Os resultados evidenciaram a potencialidade desse ligante para purificação de fragmentos Fab. INTRODUÇÃOOs fragmentos Fab, F(ab)' 2 e Fv obtidos da clivagem da IgG ou por meio da tecnologia do DNA recombinante, são proteínas que apresentam aplicações relevantes em terapias e diagnósticos. Tais biomoléculas são caracterizadas por possuírem massa molar e tempo de meia-vida inferiores ao da IgG intacta, consequentemente apresentam maior facilidade de penetração nos tecidos alvo e menor tempo de depuração plasmática (Chames et al., 2009). Nos últimos anos, vários fragmentos de IgG foram aprovados pelo FDA (Food and DrugAdministration) e têm sido empregados em diagnósticos por imagem in vivo, nas terapias de doenças degenerativas e cânceres (Hansel et al., 2010). A aplicação dos fragmentos de anticorpos nesses segmentos representa, aproximadamente, 6 bilhões de dólares por ano (Holliger e Hudson, 2005).Para serem empregados nessas aplicações é requerido um elevado grau de pureza da IgG e de seus fragmentos. Tradicionalmente, a purificação dessas biomoléculas é realizada por meio da técnica de cromatografia de afinidade, empregando como ligantes a proteína A ou a proteína G imobilizadas (Huse et al., 2002). No entanto, esses ligantes apresentam algumas desvantagens, tais como o elevado custo, o risco de desnaturação do anticorpo e de desprendimento do ligante da matriz em decorrência das condições de eluição a baixos valores de pH e o risco da inativação do ligante após sucessivos ciclos de purificação (Ayyar et al., 2012). Diante desses inconvenientes, estudos têm sido desenvolvidos visando o emprego de técnicas alternativas à cromatografia de afinidade (Coleman e Mahler, 2003; Yu e Ghosh, 2010) ou de ligantes substitutos das proteínas A e G (Khoury e Lowe, Área temática: Processos Biotecnológicos 1

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“…The total concentration of the human serum proteins was as high as 87.2 mg/mL and of high viscosity, so it was 10-fold diluted with 20 mmol/L PB (pH 6.0) (equilibration buffer) prior to loading. It should be noted that the dilution was also necessary to avoid protein aggregation when loading at high concentrations, which would block the binding sites and/or make the pores inaccessible [19]. Therefore, the serum feedstock was diluted in order for smooth purification operations by the affinity chromatography [20,21].…”

Section: Igg and Mab Purificationsmentioning

confidence: 99%