A Simplified Method for Obtaining cDNA of Low-Copy and Silent Eukaryotic Genes Using Human Renalase as an the Example

Abstract

A simplified «exon» method was developed for producing cDNA of low-copy and silent eukaryotic genes. It is based on assembly of the target gene from genomic DNA by direct synthesis of its exons, followed by their PCR-based joining without further purification of the amplicons. During the synthesis of exons, direct primers were used; these included about ~ 20 nucleotides of the 3`-terminal sequence previous (from the amplified) exon and ~ 20 nucleotides of the 5`-initial sequence of the amplified exon. Reverse primers included ~ 20 nucleotides complementary to the terminal sequence of the amplified exon. Forward and reverse primers flanking the gene to be assembled included the restriction sites necessary for insertion into the expression vector. Using this approach it is possible to assemble almost any eukaryotic gene with a known nucleotide sequence of genomic DNA available in the database.

Expression and Isolation of N-Terminal Truncated Human Recombinant Renalase in Prokaryotic Cells

“…Для изучения свойств полноразмерной RNLS и RNLS, лишенной N-концевого сигнального пептида (tRNLS), нами были сконструированы вектора для их экспрессии в бактериальной системе [11,12,16].…”

Construction of a chimeric human gene encoding renalase with a modified N-terminus

“…Выделение рекомбинантного белка осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием Ni-сефарозы в 8 М буферном растворе мочевины, как описано в наших работах [13,14].…”

“…Этот вектор был сконструирован нами ранее: в основе его получения лежало т.н. «экзоновое конструирование кодирующих последовательностей» [13,14]. Прямым праймером (Mat-RNLS-for) служила последовательность, которая включала сайт рестрикции BamHI (ggatcc) и Kozak последовательность (aatggaagcg).…”

“…В основе этого метода лежит т.н. «экзоновое конструирование кодирующих последовательностей» [13], которое было апробировано на экспрессии одной из изоформ RNLS человека [14].…”

Construction and Expression of the Chimeric Human Renalase Gene Encoding the N-Terminal Signal Sequence of the Secretory Protein Prolactin

“…При конструировании химерного гена мы использовали ранее апробированный нами метод «экзоновое конструирование кодирующих последовательностей» [14], который был использован при конструировании одной из изоформ RNLS человека [15].…”