A Branched Monomethoxypoly(ethylene glycol) for Protein Modification

Abstract

Procedures are described for linking monomethoxypoly(ethylene glycol) (mPEG) to both epsilon and alpha amino groups of lysine. The lysine carboxyl group can then be activated as a succinimidyl ester to obtain a new mPEG derivative (mPEG2-COOSu) with improved properties for biotechnical applications. This branched reagent showed in some cases a lower reactivity toward protein amino groups than the linear mPEG from which it was derived. A comparison of mPEG- and mPEG2-modified enzymes (ribonuclease, catalase, asparaginase, trypsin) was carried out for activity, pH and temperature stability, Km and Kcat values, and protection to proteolytic digestion. Most of the adducts from mPEG and mPEG2 modification presented similar activity and stability toward temperature change and pH change, although in a few cases mPEG2 modification was found to increase temperature stability and to widen the range of pH stability of the adducts. On the other hand, all of the enzymes modified with the branched polymer presented greater stability to proteolytic digestion relative to those modified with the linear mPEG. A further advantage of this branched mPEG lies in the possibility of a precise evaluation of the number of polymer molecules bound to the proteins; upon acid hydrolysis, each molecule of mPEG2 releases a molecule of lysine which can be detected by amino acid analysis. Finally, dimerization of mPEG by coupling to lysine provides a needed route to monofunctional PEGs of high molecular weight.

Un método reproducible para obtener peg biramificado monofuncional de alta pureza

“…La muestra obtenida según el procedimiento de Monfardini y colaboradores, 8 eluida con una solución 10 mmol/L de NaCl, se aplicó a una columna equilibrada como se describe en el epígrafe anterior. De forma sucesiva se aplicaron iguales volúmenes de agua y de solución de NaCl a: 100, 200 y 500 µmol/L; 1, 2, 5 y 10 mmol/L.…”

“…Esta estructura permite obtener PEG de alta masa molecular (hasta 60 kDa) y con sólo un grupo funcional (el grupo carboxílico de la L-lisina). 8 El reactivo descrito por Monfardini y colaboradores (Figura 1) ha sido utilizado con éxito en la conjugación de interferones alfa. 9,10 La simplicidad de su estructura lo hace una opción interesante para diversas aplicaciones, desde la conjugación de proteínas hasta la de superficies de biomateriales, para aumentar su compatibilidad con los organismos vivos.…”

“…Desafortunadamente, el procedimiento de síntesis descrito por estos autores es engorroso, peligroso (por ejemplo: usa fosgeno) y necesita materias primas de una calidad extremadamente alta. 8 El objetivo de este trabajo fue obtener un PEG ramificado de dos ramas y monofuncional (estructura general descrita en la Figura 1) de forma eficiente, reproducible y con alta pureza. Se partió del procedimiento descrito por Monfardini y colaboradores 8 pero se hicieron estudios de las distintas etapas para lograr el objetivo trazado.…”

“…9 El procedimiento inicial de síntesis del SC-mPEG descrito era engorroso e incluso peligroso, pues el primer paso consistía en la obtención del cloruro de ácido de PEG por reacción del polímero con fosgeno. 8 No obstante, Miron y Wilchek dieron a conocer un método muy sencillo para obtener este reactivo, basado en la reacción del mPEG-OH con DSC en presencia de DMAP (Figura 2) y posterior purificación del polímero funcionalizado por recristalización del precipitado de la mezcla reactiva por disolución en acetona y precipitación con éter dietílico. 11 En este trabajo se estudiaron diversos factores que pueden influir en el rendimiento de la reacción anterior.…”

Conjugation of siRNA with Comb‐Type PEG Enhances Serum Stability and Gene Silencing Efficiency

“…[6,17,18] Recently, comb-like PEG polymers, i.e., polyethylene glycol grafted poly(meth)acrylates, have proved to be potent alternatives to linear and branched PEG for improving the pharmacokinetics of protein drugs. [18][19][20] When compared to the linear PEG with equivalent molecular weights, the comb-like PEG displays greater steric hindrance, thus potentially enhancing biostability and lowering clearance rates of the conjugated biotherapeutics.…”