A bipartite periplasmic receptor–diguanylate cyclase pair (XAC2383–XAC2382) in the bacterium Xanthomonas citri

Abstract

The second messenger cyclic diguanylate monophosphate (c-di-GMP) is a central regulator of bacterial lifestyle, controlling several behaviors, including the switch between sessile and motile states. The c-di-GMP levels are controlled by the interplay between diguanylate cyclases (DGCs) and phosphodiesterases, which synthesize and hydrolyze this second messenger, respectively. These enzymes often contain additional domains that regulate activity via binding of small molecules, covalent modification, or protein-protein interactions. A major challenge remains to understand how DGC activity is regulated by these additional domains or interaction partners in specific signaling pathways. Here, we identified a pair of co-transcribed genes ( and ) in the phytopathogenic, Gram-negative bacterium subsp. (Xac), whose mutations resulted in opposing motility phenotypes. We show that the periplasmic cache domain of XAC2382, a membrane-associated DGC, interacts with XAC2383, a periplasmic binding protein, and we provide evidence that this interaction regulates XAC2382 DGC activity. Moreover, we solved the crystal structure of XAC2383 with different ligands, indicating a preference for negatively charged phosphate-containing compounds. We propose that XAC2383 acts as a periplasmic sensor that, upon binding its ligand, inhibits the DGC activity of XAC2382. Of note, we also found that this previously uncharacterized signal transduction system is present in several other bacterial phyla, including Gram-positive bacteria. Phylogenetic analysis of homologs of the XAC2382-XAC2383 pair supports several independent origins that created new combinations of XAC2382 homologs with a conserved periplasmic cache domain with different cytoplasmic output module architectures.

Studies on the enzymatic specificity of diguanylate cyclases domains and the production of new second messengers

“…The induction was for one hour at 37 ºC. Fluorescence microscope assays were done with BL21(DE3) strains transformed with pBiocdiGMP and pBRA vector constructs expressing XAC2382_HG (residues 198-446) or XAC2382_HGE (residues 198-705) (pBRA plasmids construction described in Teixeira et al, 2018). For these assays, we grew the strains in 5 mL of 2XTY broth at 37 ºC until an OD600 between 0.6 -0.8 followed by the addition A mutant E. coli strain from Keio collection (Baba et al, 2006) with a kanamycin resistance cassete inserted in the dGTPase gene was kindly donated by Prof. Beny Spira from the ICB-USP.…”

Classificação e evolução de SBPs em contexto de transdução de sinal: interação entre SBPs e Cache

“…306, porém, nesse caso, o domínio efetor tem atividade de diguanilato ciclase e o domínio sensor periplasmático é um sCache. Os autores provaram a existência de uma interação física entre a proteína codificada pelo gene XAC2382, um SBP-II, com o produto do gene vizinho, XAC2383, que codifica uma proteína da famíia GGDEF com domínio sensor da família sCache_3_2(Teixeira et al 2018). Embora esses autores não tenham conseguido encontrar um ligante de alta afinidade, eles identificaram uma preferência por compostos carregados negativamente contendo íons fosfato.…”

“…Embora esses autores não tenham conseguido encontrar um ligante de alta afinidade, eles identificaram uma preferência por compostos carregados negativamente contendo íons fosfato. Esses autores fizeram ainda a primeira análise filogenética dos domínios citoplasmáticos e extracelulares dessas proteínas, demonstrando que o par de domínios SBP e Cache nesses genes permanece associado, como uma unidade conservada, enquanto o domínio efetor citoplasmático muda, podendo ser substituído por histidina quinases ou MCPs(Teixeira et al 2018).Finalmente, outros exemplos de interação de SBPs com domínios sensores foram reportados, como a interação do sensor quimiotático Tar de Escherichia coli, um MCP com domínios periplasmáticos do fold 4HB, e a proteína MBP, um SBP especializado no reconhecimento do açúcar maltose…”

“…Figura 2. Fluxograma de análise deste trabalho: Começa pela coleta de genomas procarióticos completos e não redundantes; coleta de homologos de SBP e Cache; classificação das proteínas por identidade de sequência e coleta de vizinhança gênica; análise comparativa O conjunto dessas predições foram combinados usando scripts em Perl desenvolvidos por nosso grupo e que geraram uma descrição sucinta da arquitetura de domínios de Coleta dos homólogos de SBPs Foram coletadas, no banco de dados PDB, 501 estruturas de proteínas descritas como substrate-binding protein(Scheepers, Lycklama A Nijeholt, and Poolman 2016), além da proteína 5UB6 referente ao gene XAC2383(Teixeira et al 2018). Para cada uma das estruturas coletadas, a extração das sequências de aminoácidos correspondente à estrutura foi feita usando o pacote Bio3D(Skjaerven et al 2014).…”

“…Executamos também buscas de 5 iterações com o software Jackhmmer, usando as regiões correspondentes as domínios Cache das seguintes proteínas: 46 a 175 de XAC2382 (WP_003486063.1) de Xanthomonas citri pv. citri(Teixeira et al 2018), 26 a 223 de MbaA (NP_230352.1) de Vibrio cholerae(Teixeira et al 2018; Apenas proteínas com no máximo duas hélices foram preservadas e as regiões extracelulares preditas foram obtidas isolando do primeiro aminoácido até a primeira hélice transmembrana, nos casos de proteínas com uma TM, ou a região entre as duas hélices transmembrana, no caso de proteínas com duas hélices.O conjunto de regiões extracelulares preditas foi reduzido, eliminando-se as regiões absolutamente idênticas (100% de cobertura e 100% de identidade). O conjunto de fragmentos não redundantes foi classificado em dois níveis: o primeiro constituído de grupos com identidade de até 70% e cobertura de 80%, e o segundo em grupos com 80% de cobertura e e-value máximo de 10 -3 foram identificados.…”