5 S rRNA and tRNA Import into Human Mitochondria

Abstract

In vivo, human mitochondria import 5 S rRNA and do not import tRNAs from the cytoplasm. We demonstrated previously that isolated human mitochondria are able to internalize a yeast tRNA Lys in the presence of yeast soluble factors. Here, we describe an assay for specific uptake of 5 S rRNA by isolated human mitochondria and compare its requirements with the artificial tRNA import. The efficiency of 5 S rRNA uptake by isolated mitochondria was comparable with that found in vivo. The import was shown to depend on ATP and the transmembrane electrochemical potential and was directed by soluble proteins. Blocking the pre-protein import channel inhibited internalization of both 5 S rRNA and tRNA, which suggests this apparatus be involved in RNA uptake by the mitochondria. We show that human mitochondria can also selectively internalize several in vitro synthesized versions of yeast tRNA Lys as well as a transcript of the human mitochondrial tRNA Lys . Either yeast or human soluble proteins can direct this import, suggesting that human cells possess all factors needed for such an artificial translocation. On the other hand, the efficiency of import directed by yeast or human protein factors varies significantly, depending on the tRNA version. Similarly to the yeast system, tRNA Lys import into human mitochondria depended on aminoacylation and on the precursor of the mitochondrial lysyl-tRNA synthetase. 5 S rRNA import was also dependent upon soluble protein(s), which were distinct from the factors providing tRNA internalization.Mitochondria, although containing their own genome, import the vast majority of their macromolecular components from the cytoplasm. If the mechanisms of pre-protein import are well understood, the import of nuclear-coded RNAs into mitochondria was investigated to a much lesser extent. Targeting of RNA into mitochondria though not universal is widely spread among organisms (1-5). Mitochondrial import of transfer RNAs was found in plants, protists, some lower animals, and fungi. The number of imported tRNA species varies from one (in yeast) to the totality (in trypanosomatids), and tRNA import mechanisms seem to differ from one organism to another. We have shown previously that, in the yeast Saccharomyces cerevisiae, import of a single tRNA CUU Lys (further referred to as tRK1) 1 occurs via formation of a complex with the precursor form of the mitochondrial lysyl-tRNA synthetase (pre-MSK) and requires the intactness of pre-protein import apparatus (6 -8).In mammalians, no tRNA import has been reported, but several other RNAs are thought to be targeted into mitochondria. One of these is the RNA component of RNase MRP, a site-specific endoribonuclease supposed to be involved in primer RNA cleavage during replication of mitochondrial DNA and to be present in the organelle in a very low amount (9). It was hypothesized that the process of mitochondrial DNA replication requires a very low number of MRP RNA molecules per mitochondrial genome (10 -12). The presence of MRP RNA in the mitochondria was recent...

Adresser du matériel allogène dans le compartiment mitochondrial

“…-mais elles préparent les outils thérapeutiques de demain pour vaincre les maladies mitochondriales. ‡ À côté de ces manipulations permettant l'adressage artificiel d'ARNt, les mitochondries humaines, comme noté plus haut, ont la compétence d'importer, de façon naturelle cette fois, l'ARNr 5S [12]. Cet import requiert de l'énergie sous forme d'ATP et la pré-sence de protéines additionnelles, suggérant que, comme celui des ARNt, ce transport s'effectue par le biais du système d'import des protéines.…”

RNA import into mitochondria and its use in gene therapy

“…Было показано, что элементы, важные для импорта в митохондрии, располагаются лишь в двух из этих доменов; при этом любые мутации (и даже большие вставки) в третьем домене никак не влияли на эффективность импорта [12]. В раз-работанной для изучения механизмов импорта 5S рРНК системе in vitro было показано, что дан-ный процесс зависит от АТФ и мембранного по-тенциала митохондрий, а также требует присутст-вия растворимых цитозольных белков [13]. Впо-следствии была реконструирована минимальная система импорта 5S рРНК в изолированные мито-хондрии клеток человека, состоящая из двух таких белков -митохондриальной тиосульфатсульф-отрансферазы, или роданезы [14], и предшественни-ка митохондриального рибосомного белка L18 [15].…”

“…Тому были полу-чены косвенные подтверждения. Во-первых, ко-личество молекул 5S рРНК в митохондриях чрез-вычайно близко к количеству митохондриальных рибосом [13]. Во-вторых, подавление экспрессии гена роданезы методом РНК-интерференции при-водило к значительному уменьшению количества 5S рРНК в митохондриях и одновременно к про-порциональному ослаблению митохондриальной трансляции [14].…”

“…Несмотря на то что in vivo тРНК в митохонд-рии млекопитающих не проникают, было показано, что импортируемая дрожжевая тРНК проникает в изолированные митохондрии клеток человека, причем этот процесс может обеспечиваться как дрожжевым, так и человеческим клеточным бел-ковым экстрактом [13]. Таким образом, в клетках человека содержатся все необходимые для им-порта тРНК факторы, а тот факт, что человеческие тРНК не импортируются в митохондрии, объяс-няется значительным отличием их структур от структуры импортируемой дрожжевой тРНК.…”

“…Интересно, что помимо импортируемой дрожже-вой тРНК в митохондрии человека импортируют-ся также ее мутантные версии и некоторые другие дрожжевые тРНК [13]. Экспрессируясь в клетках человека, эти тРНК эффективно аминоацилиру-ются лизином и проникают в митохондрии [21].…”