Otimização de metodologia para o estudo de genes KIR

Abstract

Receptores killer cell immunoglobulin-like (KIRs) são moléculas localizadas na superfície de células natural killer (NK) e em subpopulações de linfócitos T codificadas por genes do cromossomo 19q13.4. A interação entre receptores KIR e moléculas antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I determina se células NK exercerão ou não sua função citotóxica e/ou secretora de citocinas ou se esta será inibida. Este trabalho teve por finalidade otimizar a metodologia para a genotipagem KIR, baseando-se nas condições descritas por Martin (2004). A técnica utilizada foi a reação em cadeia da polimerase com primers de sequência específica (PCR-SSP) com iniciadores sintetizados pela Invitrogen ® e visualização do produto amplificado em gel de agarose a 2% com brometo de etídio. Adaptações foram realizadas e a concentração de alguns reagentes foi alterada, como a do controle interno de 100 nM para 150 nM, iniciadores específicos senso e antissenso de KIR12.5/12.3, KIR13.5/13.3, KIR14.5/14.3, KIR22.5/22.3 e KIR36.5/36.3 de 500 nM para 750 nM e da solução de MgCl 2 de 1,5 mM para 2 mM. As concentrações dos demais reagentes e temperaturas de amplificação foram mantidas. Nessas condições, o uso da Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen ®) foi satisfatório. Os resultados das genotipagens de 70 indivíduos foram confirmados por rSSO-Luminex ® (One Lambda, Canoga Park, CA, EUA). A tipagem de genes KIR por essa técnica apresentou sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e baixo custo.

Influence of KIR genes and their HLA ligands in susceptibility to dengue in a population from southern Brazil

“…For KIR genotyping, the polymerase chain reaction was used with the sequence‐specific primer (PCR‐SSP) technique, according to Rudnick et al for the following fourteen genes and one pseudogene: KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR3DS1 and KIR2DP1 . The amplified DNA fragments were separated by electrophoresis on 2.0% agarose gels and visualised by staining with Sybr Green (Invitrogen, Carlsbad, CA).…”

Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA ligands in a Brazilian population

“…The deleted and non-deleted major full-length subtypes and deleted forms of KIR2DS4 were analyzed by PCR-SSO. Samples with ill-defined results were confirmed by an in-house polymerase chain reaction with sequence-specific primers (PCR-SSP) according to Martin et al, 4 and optimized by Rudnick et al 21 …”