Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli

Chiarini, Eb; Penna, Thereza Christina Vessoni

doi:10.1590/s1516-93322003000400014

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“…Expression, extraction, and purification of recombinant GFP by E. coli DH5-a followed protocol previously published by Chiarini and Penna. 59 GFP fluorescence intensity was determined by spectrofluorometer with k excitation ¼ 394 nm and k emission ¼ 509 nm (RF 5301 PC, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Commercial purified recombinant GFP (95%; Clontech, Palo Alto, CA, USA) was used to generate a standard curve to estimate expressed extracted and purified GFP concentration from the fluorescence intensity.…”

Section: Experimental Designmentioning

confidence: 99%

LPS removal from an E. coli fermentation broth using aqueous two‐phase micellar system

Lopes

Magalhães

Mazzola

et al. 2010

Biotechnology Progress

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In biotechnology, endotoxin (LPS) removal from recombinant proteins is a critical and challenging step in the preparation of injectable therapeutics, as endotoxin is a natural component of bacterial expression systems widely used to manufacture therapeutic proteins. The viability of large-scale industrial production of recombinant biomolecules of pharmaceutical interest significantly depends on the separation and purification techniques used. The aim of this work was to evaluate the use of aqueous two-phase micellar system (ATPMS) for endotoxin removal from preparations containing recombinant proteins of pharmaceutical interest, such as green fluorescent protein (GFPuv). Partition assays were carried out initially using pure LPS, and afterwards in the presence of E. coli cell lysate. The ATPMS technology proved to be effective in GFPuv recovery, preferentially into the micelle-poor phase (K(GFPuv) < 1.00), and LPS removal into the micelle-rich phase (%REM(LPS) > 98.00%). Therefore, this system can be exploited as the first step for purification in biotechnology processes for removal of higher LPS concentrations.

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Section: Experimental Designmentioning

confidence: 99%

LPS removal from an E. coli fermentation broth using aqueous two‐phase micellar system

Lopes

Magalhães

Mazzola

et al. 2010

Biotechnology Progress

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“…Sua análise qualitativa pode ser realizada por microscopia de fluorescência ou por observação em lâmpada UV de comprimento de onda entre 365 -395 nm (CHIARINI et al, 2003). Por outro lado, sua análise quantitativa pode ser realizada por fluorimetria e citometria de fluxo.…”

Section: Gfpunclassified

Utilização do sistema SFV em macrófagos.

Sousa¹

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“…A GFP constitui-se também de um indicador biológico potencial para validação de desempenho de processos de desinfecção, pasteurização e de branqueamento (CHIARINI e PENNA, 2003). Um conhecimento detalhado da estabilidade da GFP pode ser de suma importância para uma aplicação da GFP como um sensor molecular (DIETZ e RIEF, 2004).…”

Section: Lista De Figurasunclassified

“…A extração direta por partição em três fases (TPP) tem sido utilizada para extrair, concentrar e purificar proteínas de origem vegetal e bacteriana. O método TPP combina vários princípios de extração, quais sejam: precipitação salina convencional (salting-out), precipitação isoelétrica, precipitação por cossolvente; pressão osmótica e cosmotropia (CHIARINI e PENNA, 2003).…”

Section: Extraçãounclassified

Efeito de polímeros e sais na estabilidade térmica da proteína verde fluorescente (GFP)

Novaes¹

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v AGRADECIMENTOS À profª Drª Thereza Chrisitna Vessoni Penna pela orientação, suporte e incentivo, que durante estes anos de convivência muito me ensinou, contribuindo para o meu crescimento. À todos os alunos de iniciação científica do Laboratório de Microbiologia Aplicada, em especial ao Flávio e Saulo, que contribuíram para a realização deste trabalho. Aos professores do Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica, em especial ao prof. Adalberto Pessoa Júnior, que contribuiu para a realização deste trabalho. À Angela e a Priscila, pelo apoio, incentivo, e amizade. Aos amigos e companheiros de disciplinas e laboratórios Marilene e Ivani, pelo apoio, convívio e amizade. Aos funcionários da Secretaria de Pós Graduação: Elaine e Jorge, pelo auxílio, esforço e eficiência. vi À Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP e ao Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica, pela oportunidade de realização do curso de mestrado. À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo e ao Conselho Nacional de Pesquisa, pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa.À minha família que sempre esteve presente e me auxiliou em todos os momentos. Agradeço por tudo e a todos que de alguma forma me auxiliaram no desenvolvimento deste trabalho. vii RESUMO NOVAES, L. C. L. Efeito de polímeros e sais na estabilidade térmica da proteína verde fluorescente (GFP). 2009, 88f Dissertação (Mestrado) -Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2009 O emprego de aditivos hidrossolúveis como açúcares, tensoativos, sais e polímeros é prática comum na tentativa de se estabilizar proteínas durante aquecimento. Diversos polímeros têm sido utilizados para estabilizar proteínas, sendo seu efeito dependente das características da proteína. Sais podem estabilizar, desestabilizar ou não ter efeito na estabilidade de proteínas; dependendo do tipo, concentração, natureza das interações iônicas e resíduos carregados da proteína. A termoestabilidade da proteína verde fluorescente (GFP) tem sido demonstrada ao calor úmido, à temperaturas elevadas (T ≥ 95°C), à valores de pH alcalinos e a alguns agentes químicos. Sua denaturação térmica é altamente reprodutível e a variação da intensidade de fluorescência pode ser facilmente determinada por espectrofluorimetria. O objetivo deste trabalho foi estudar o comportamento da GFP na presença de diferentes soluções aquosas de polímeros (polietileno glicol, DEAE-Dextrana e ácido poliacrílico) e sais (citrato e fosfato). A partir dos dados obtidos, pode-se concluir que o citrato favoreceu a preservação da estrutura nativa da GFP nas temperaturas estudadas (70 a 95ºC), em concentrações acima de 10% m/m. O ácido poliacrílico também auxiliou na manutenção da estrutura nativa da GFP, porém em menor intensidade, e com concentrações acima de 20% m/m. ABSTRACTThe addition of hydrosoluble excipients, such as, sugars, surfactants, salts and polymers is a common practice in the intent of stabilization of proteins during heating. Several polymers have been used to proteins stabilizatio...

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Extração, purificação e caracterização físico-química da proteína verde fluorescente recombinante (GFPuv) expressa em Escherichia coli

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LPS removal from an E. coli fermentation broth using aqueous two‐phase micellar system

LPS removal from an E. coli fermentation broth using aqueous two‐phase micellar system

Utilização do sistema SFV em macrófagos.

Efeito de polímeros e sais na estabilidade térmica da proteína verde fluorescente (GFP)

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