Padronização da titulação da toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D em linhagem contínua de células como alternativa ao bioensaio animal

Abstract

Enterotoxemia, também chamada de doença do rim pulposo, doença que acomete os ruminantes domésticos, é causada pela ação da toxina épsilon produzida pelo Clostridium perfringens tipo D, um anaeróbio comumente isolado do solo e das fezes de animais sadios. O método tradicional de diagnóstico baseia-se na detecção e classificação dessa exotoxina no conteúdo intestinal por meio da soroneutralização em camundongos. Com isso, o objetivo deste estudo foi padronizar um teste para detecção e titulação dessa toxina in vitro e compará-lo ao fenômeno in vivo. Para isso, uma partida de toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D foi titulada em camundongos e em várias linhagens contínuas de células. Após a determinação da linhagem celular mais sensível, realizaram-se ensaios de titulação in vitro de diluições de uma partida de toxina, comparando-os com os títulos in vivo conhecidos. Os resultados foram agrupados, e foi desenvolvida a equação matemática que melhor adaptou-se aos intervalos trabalhados. A linhagem MDCK, além de mais sensível, demonstrou que o fenômeno observado in vitro pode ser expresso por meio da equação matemática que apresenta uma correlação de 98,33%, com a dose mínima mortal determinada in vivo. Portanto, a linhagem MDCK permite titular a toxina épsilon de C. perfringens tipo D de forma específica e sensível, além de ser uma técnica prática, rápida e que dispensa o uso de animais.

In vitro evaluation of Clostridium septicum alpha toxoid

“…The supernatant was removed after this period. Staining was done with 100µL of crystal violet solution (0.1% in alcohol) to observe the cytopathic effect (CPE) (Souza Júnior et al, 2010). CPE was considered to be the destruction of 100% of the cellular monolayer.…”

“…The plate was read as previously described. Retrotitration with standard anti-toxin was used to check the standardization of the toxin (Souza Júnior et al, 2010).…”

In vitro potency test for evaluation of Clostridium perfringens type D epsilon toxoid

“…The supernatant was removed after this period. Staining was done with 100 μL of crystal violet solution (0.1% in alcohol) to observe the cytopathic effect (CPE) (Souza Júnior et al, 2010). Titers of the test sera were calculated as the highest dilution, resulting in 70% destruction of the cell monolayer (Knight et al, 1990).…”