Purification and partial characterization of Phaseolus vulgaris seed aminopeptidase

Abstract

The aminopeptidase activity of Phaseolus vulgaris seeds was measured using L-Leu-p-nitroanilide and the L-aminoacyl-ß-naphthylamides of Leu, Ala, Arg and Met. A single peak of aminopeptidase activity on Leu-ß-naphthylamide was eluted at 750 µS after gradient elution chromatography on DEAE-cellulose of the supernatant of a crude seed extract. The effluent containing enzyme activity was applied to a Superdex 200 column and only one peak of aminopeptidase activity was obtained. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (10%) presented only one protein band with molecular mass of 31 kDa under reducing and nonreducing conditions. The aminopeptidase has an optimum pH of 7.0 for activity on all substrates tested and the highest Vmax/K M ratio for L-Leu-ß-naphthylamide. The enzyme activity was increased 40% by 0.15 M NaCl, inhibited 94% by 2.0 mM Zn 2+ , inhibited 91% by sodium p-hydroxymercuribenzoate and inhibited 45% by 0.7 mM o-phenanthroline and 30 µM EDTA. Mercaptoethanol (3.3 mM), dithioerythritol (1.7 mM), Ala, Arg, Leu and Met (70 µM), p-nitroaniline (0.25 mM) and ß-naphthylamine (0.53 mM) had no effect on enzyme activity when assayed with 0.56 mM of substrate. Bestatin (20 µM) inhibited 18% the enzyme activity. The aminopeptidase activity in the seeds decayed 50% after two months when stored at 4 o C and room temperature. The enzyme is leucyl aminopeptidase metal-and thiol group-dependent.

Mobilization of seed protein reserves

“…The final products of the action of the endopeptidases and serine carboxypeptidases are presumed to be a mixture of free amino acids and small oligopeptides. In dicots, these would then be transported out of the PSV into the cytosol, where the peptides would be degraded further to amino acids by the action of aminopeptidases (Abdala et al 1999). In monocots, membrane transporters in the epidermal cells of the scutellum allow the uptake of oligopeptides and amino acids from the endosperm into the embryo (Waterworth and Bray 2006).…”

Detection and quantification of leucyl aminopeptidase after native electrophoresis using leucine-p-nitroanilide

“…There are few data in the literature concerning kidney bean leucyl aminopeptidase so far. Some purification and characteriza- tion studies [10,16] did not report the existence of isoenzyme forms in resting kidney bean. Figure 1 shows three isoforms which we detected in this way.…”

Caracterización de la actividad proteolítica de extractos semipurificados de Vigna unguiculata

“…Ese bajo peso molecular es el esperado para enzimas hidrolíticas con actividad proteolítica. El resultado coincide con lo encontrado por Abdala et al (1999), quienes aislaron una aminopetidasa a partir del Phaseolus vugaris, con un peso molecular cercano a los 30 kDa y un pH óptimo de 7; y lo hallado por Budič et al (2016), quienes aislaron una enzima proteolítica del tipo serin proteasa a partir del Phaseolus vugaris con un peso molecular de 37 kDa. Esto demuestra que el proceso de purificación diseñado fue efectivo.…”

“…Este hecho ha motivado el interés en fuentes de origen vegetal, que presentan ventajas tales como bajos costos de inversión en procesos de extracción y purificación, estabilidad en una amplia gama de condiciones operativas (temperatura, pH, salinidad y solventes orgánicos), alta afinidad a una amplia variedad de sustratos y posibilidad de inmovilización(Troncoso et al, 2022). Existe evidencia científica que demuestra la alta concentración de proteasas en las semillas de leguminosas(Abdala et al, 1999;Cruz de Carvalho et al, 2001).En lo que respecta al proceso de aislamiento de la fracción proteica, diversas investigaciones han propuesto distintas metodologías factibles(Eltayeb et al, 2011;Budič et al, 2016); sin embargo, no existe un método estándar de purificación. Es por ello que se continúan desarrollando estudios en esta área, así como a nivel de los pretratamientos de las semillas para mejorar los rendimientos y propiedades nutritivas, tales como la fermentación(Çabuk et al, 2018).En consecuencia, dado que las leguminosas son una fuente de proteínas vegetales económicas y que se producen todo el año en los países de clima tropical, se planteó como objetivo diseñar una metodología para aislar y purificar parcialmente proteasas a partir del frijol pico negro (Vigna unguiculata).…”