Hemes férricos pentacoordenados e hexacoordenados dos monômeros d nativo e reconstituído da hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus: estudos espectroscópicos em meio ácido

Abstract

Recebido em 24/8/04; aceito em 4/1/05; publicado na web em 13/4/05 PENTACOORDINATE AND HEXACOORDINATE FERRIC HEMES FROM THE NATIVE AND RECONSTITUTED d MONOMERS OF Glossoscolex paulistus EXTRACELLULAR HEMOGLOBIN: SPECTROSCOPIC STUDIES IN ACID MEDIUM. UV-Vis and fluorescence spectroscopic studies of the native and reconstituted d monomers of Glossoscolex paulistus were performed in acid medium.The coexistence of distinct species shows the complexity of the equilibria. Besides the hexacoordinate low spin hemichrome, with bands at 535 and 565 nm, a pentacoordinate high spin hemichrome is identified by the blue-shifted low intensity Soret band (371 nm) and the LMCT band (643 nm). The pentacoordinate hemichrome must be related to the partial unfolding of the polypeptide.Keywords: extracellular hemoglobin; hexacoordinate; pentacoordinate. INTRODUÇÃOA hemoglobina (Hb) extracelular gigante de Glossoscolex paulistus é uma hemoproteína oligomérica 1 com uma massa molecular de 3,1 MDa 2 . Pertencente à mesma classe do anelídeo Lumbricus terrestris, que tem sido intensamente investigado [3][4][5][6][7][8][9] , essa hemoglobina ainda permanece intrigante sob vários aspectos da sua relação estrutura/atividadeSua estrutura apresenta 144 globinas e 36 cadeias polipeptídicas sem o grupo prostético heme que são cruciais para sua integridade estrutural (cadeias "linkers") 10 , sendo que o arranjo da hemoglobina íntegra se dispõe espacialmente como 2 discos hexagonais sobrepostos, com as subunidades estabilizadoras, "linkers" na parte central 7 . As 144 globinas estão organizadas como 12 dodecâmeros, sendo que cada dodecâmero consiste em um conjunto de 3 tetrâmeros. Cada tetrâmero, por sua vez, é constituído por 3 trímeros (cadeias a, b, c unidas covalentemente através de ligações dissulfeto) e 1 cadeia monomérica d 6,11 . Tendo-se em vista a menor complexidade do estudo biofísico de uma única subunidade ao invés da proteína íntegra propriamente dita, o monômero d, previamente modelado por Cabral e colaboradores 12 , foi isolado visando a caracterização das espécies presentes em equilíbrio químico, em meio ácido. De fato, a complexidade do equilíbrio de hemoproteínas vem motivando estudos em função da coexistência de várias espécies em cada valor de pH [13][14][15][16][17][18] , sendo que estas podem diferir em relação ao estado de spin e aos ligantes axiais propriamente considerados. Neste particular, pode haver espécies com números de coordenação diferenciados, ou seja, é possível a coexistência de formas hexacoordenadas, pentacoordenadas 13,18 e, até mesmo, tetracoordenadas 19,20 . Vários trabalhos vêm enfatizando a relação entre a formação de espécies pentacoordenadas e um processo inicial de desenovelamento da cadeia polipeptídica, o que aumenta, ainda mais, a relevância da caracterização destas espécies, devido a suas possíveis implicações com fenômenos de desnaturação 19,20 . Por outro lado, sabe-se que há reconstituições de hemoproteínas que implicam na perturbação da estrutura terciária 21 , assim como outras que não afet...

Estudo espectroscópico do equilíbrio entre espécies hexacoordenada e pentacoordenada dos monômero d nativo e reconstituído da hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus em meio alcalino

“…Entretanto, os comprimentos de onda observados para esta espécie pentacoordenada em meio alcalino diferem, significativamente, dos valores encontrados para o monômero d pentacoordenado em meio ácido, conforme descrito em trabalho anterior 23 . É prová-vel que o ligante imidazólico proveniente da histidina distal se encontre desprotonado em função da alta alcalinidade do meio quando ocorre a transição em questão.…”

“…Esta proposta também é plausível se for levada em consideração a significativa eletroafinidade do centro metálico em estado de oxidação 3+, o que causaria uma atração eletrostática muito maior pelo imidazolato, que é um grupo aniônico, que pelo ligante neutro imidazol. Esta saída mais pronunciada do íon férrico causaria o deslocamento hipsocrômico da banda de transferência de carga do ligante para o metal (TCLM) em relação ao pentacoordenado em meio áci-do 23 . De qualquer maneira, Boffi e colaboradores 64 estabeleceram que a presença da banda de transferência de carga, d (íon férrico) → π (heme), tanto em 602 como em 635 nm, indica a presença de complexos de ferro alto-spin, o que corrobora a presente discussão.…”

“…Foram identificadas duas espécies hexacoordenadas, que são as formas aquometa e hemicromo, assim como a espécie pentacoordenada, cujo quinto ligante seria o grupo imidazolato da histidina proximal, o que difere este pentacoordenado daquele encontrado em meio ácido, cujo imidazol histidínico não está desprotonado 23 . A identificação da espécie pentacoordenada é efetuada através do deslocamento hipsocrômico da banda de Soret e da diminuição da absortividade molar desta mesma banda, além da ocorrência da banda TCLM em comprimento de onda característico de configurações eletrônicas alto spin.…”

“…Deste modo, a proposta deste estudo é avaliar os equilíbrios químicos das espécies formadas na primeira esfera de coordenação do centro férrico do monômero d em função do pH, em meio alcalino, uma vez que o trabalho anterior 23 foi desenvolvido em meio ácido. Esta análise pode apresentar correlações com os me-canismos de desenovelamento polipeptídico da globina, principalmente em meios mais drásticos para a proteína, como por ex., valores extremos de pH.…”

Influência de diferentes sistemas de solvente água-etanol sobre as propriedades físico-químicas e espectroscópicas dos compostos macrocíclicos feofitina e clorofila α

“…1,38,39,41 Esse deslocamento ocorre porque, além das fortes interações intermoleculares entre as estruturas macrocíclicas, decorrente da formação dos agregados moleculares, 40 o orbital antiligante π é mais acessível e mais polarizável que o orbital ligante π, o que é favorecido por um aumento na polaridade do sistema de solventes. [38][39][40][42][43][44][45] A Figura 6 apresenta os espectros de excitação da Pheo. Para misturas de solventes com maiores conteúdos de etanol os espectros exibem elevada intensidade de emissão de fluorescência, o que indica a presença de maiores proporções de monômeros isolados.…”