Programmierbare und hochaufgelöste In‐vitro‐Detektion von genomischem 5‐Methylcytosin durch TALEs

Abstract

Genexpression ist stark durch spezifische Muster von genomischem 5-Methylcytosin (mC) reguliert, aber die direkte Detektion dieser Modifizierung an benutzerdefinierten Genorten ist nur eingeschränkt mçglich, unter anderem, weil es keine Proteine gibt, die zwischen mC und Cytosin (C) unterscheiden kçnnen und zugleich eine inhärente, programmierbare Sequenzselektivität bieten. Die hier vorgestellte Methode zur mC-Detektion beruht auf mC-abhängiger Steuerung der DNA-Replikation und zeigt eine unerwartet ausgeprägte mC-Sensitivität von Transkriptionsaktivator-artigen Effektoren (TALEs). Damit kann der Methylierungsstatus und -grad an einzelnen C-Positionen von Oligonucleotiden für die N-terminalen und zentralen Regionen von TALEs eindeutig evaluiert werden, unabhängig von der Zielsequenz. Dies spricht für eine breite Anwendbarkeit und Robustheit der Methode zur hochaufgelçsten mC-Detektion und ermçglicht die Erkennung von mC an einzelnen Positionen in großen eukaryotischen Genomen.

Interrogating Key Positions of Size-Reduced TALE Repeats Reveals a Programmable Sensor of 5-Carboxylcytosine

“…TALEs bore a single mutant repeat opposite nucleotide position 6 of the target oligonucleotide duplexes that contained C, 5mC, 5hmC, 5fC, or 5caC in later in vitro assays (Figure 2a). To study the selectivity of TALE repeats, we employed an assay based on the ability of TALEs to control DNA replication (Figure 2b) 31 in a synthetic oligonucleotide primer-template complex. This assay inversely correlates TALE affinity with the accessibility of the complex for the DNA polymerase, and thus with the amount of formed primer extension product which can be resolved by PAGE (Figure 2c.…”