Miniaturization and Validation of a Sensitive Multiparametric Cell-Based Assay for the Concomitant Detection of Microtubule-Destabilizing and Microtubule-Stabilizing Agents

Abstract

The authors describe a cell-based assay for anti-microtubule compounds suitable for automation. This assay allows the identification, in a single screening campaign, of both microtubule-destabilizing and microtubule-stabilizing agents. Its rationale is based on the substrate properties of the tubulin-modifying enzymes involved in the tubulin tyrosination cycle. This cycle involves the removal of the C-terminal tyrosine of the tubulin α-subunit by an ill-defined tubulin carboxypeptidase and its readdition by tubulin tyrosine ligase. Because of the substrate properties of these enzymes, dynamic microtubules, sensitive to depolymerizing drugs, are composed of tyrosinated tubulin, whereas nondynamic, stabilized microtubules are composed of detyrosinated tubulin. Thus depolymerization or stabilization of the microtubule network can easily be detected with doubleimmunofluorescence staining using antibodies specific to tyrosinated and detyrosinated tubulin. The authors have scaled this assay to the 96-well plate format and adapted its process for an automated handling, including a readout using a microplate reader. They describe the different steps of this adaptation. This assay was validated using known compounds. This new cellbased assay represents an alternative to both global cytotoxicity assays and in vitro tubulin assembly assays commonly used for the detection of microtubule poisons. (Journal of Biomolecular Screening 2006:377-389)

Pharmacological Inhibition of LIM Kinase Stabilizes Microtubules and Inhibits Neoplastic Growth

“…The screen was conducted as described in the work of Vassal and colleagues (14). For a summarized description, see the Supplementary Methods.…”

“…We therefore conducted a screening using a cell-based assay that probes the microtubule polymerization status (14). We identified a compound (Pyr1) that slows down microtubule dynamics.…”

Les criblages phénotypiques ou comment faire d’une pierre deux coups

“…L'emploi de plusieurs marqueurs dans un même test est un bon compromis entre quantité d'informations recueillie et cadence. Ainsi, nous avons développé un test multiparamétrique visant à repérer des molé-cules actives sur les microtubules cellulaires [12]. Ce test, associé à une stratégie de postcriblage adaptée, a permis la découverte de molécules ciblant directement la tubuline [13]ou des protéines régu-latrices de la dynamique microtubulaire [5] (Figure 5).…”

“…Suite à la sélection d'une molécule, une série de tests complémentaires est nécessaire pour restreindre le champ d'investigations. Ainsi, après le criblage décrit plus haut [12], les molécules actives sur les microtubules ont été testées sur l'assemblage in vitro de la tubuline, afin de séparer celles qui agissent directement de celles qui agissent de manière indirecte sur la tubuline, ces dernières ayant ensuite été soumises à de nouveaux tests fonctionnels en vue d'identifier leur cible biologique. Ces tests complémentaires appropriés sont cruciaux pour la réussite de ces recherches.…”

“…Mise au point d'un test cellulaire pour sélectionner des agents stabilisants des microtubules et des agents dépolymérisants [12] Criblage de 14 720 molécules de la chimiothèque nationale*, sous-chimiothèque développée par l'Institut Curie Recherche de la cible en utilisant la molécule comme hameçon La molécule n'est pas active : la molécule cible une protéine régulatrice des microtubules • Comparaison du phénotype induit par la molécule avec les phénotypes de mutants de perte partielle ou totale de fonction (cellules traitées par des si/shARN ou organismes modèles) ou induits par des molécules chimiques dont on connaît la cible(comparaison des signatures pharmacologiques). Ces méthodes réclament l'accès à des bases de données exhaustives [25].…”