Penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT) secara tepat dengan dosis yang sesuai dapat menunjang pertumbuhan tanaman tembakau yang optimal. Media tanam merupakan tempat berkembangnya akar dan hampir semua unsur hara yang dibutuhkan tanaman diserap melalui akar. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pemberian ZPT dan berbagai komposisi media tanam terhadap pertumbuhan benih tembakau cerutu besuki. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak lengkap (RAL) faktorial terdiri dari dua faktor. Faktor pertama yaitu pencampuran IAA, BAP, dan GA3 dengan konsentrasi 100 ppm (Z1), 200 ppm (Z2), 300 ppm (Z3). Faktor kedua yaitu tiga komposisi media yaitu tanah (kontrol), tanah + kompos kambing, tanah + kompos ayam. Benih ditabur dalam bak kecambah sebanyak 1 gram. Semua perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Pengamatan dilakukan setiap seminggu sekali sampai umur 45 hari. Parameter yang diamati meliputi tinggi tanaman (cm), diameter batang (cm), jumlah daun, panjang akar (cm), volume akar (ml), Luas daun (cm 2) dan parameter senyawa kimia yang diamati yaitu kadar protein (mg/g), kadar klorofil (mg/L), dan kadar nikotin (%) pada daun. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian media tanam tanah dengan kompos ayam dan aplikasi ZPT konsentrasi 200 ppm merupakan perlakuan yang optimal untuk memperoleh benih tumbuh tembakau cerutu yang baik. Kata kunci: Benih tembakau, zat pengatur tumbuh, media tanam Effect of Addition of Growth Regulatory Substances (ZPT) and Planting Media on Changes in Besuki Cigar Tobacco Seeds (Nicotiana tabacum L.