In vitro organogenesis and plant regeneration from unpollinated ovary cultures of Azadirachta indica

Abstract

A novel method of organogenesis in neem (Azadirachta indica A. Juss.) from unfertilized ovaries is described. The Murashige and Skoog's (MS) medium with 9 % sucrose, 1 μM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 5 μM 6-benzylaminopurine (BAP) was the best for callus induction from unfertilized ovaries. However, further proliferation of callus occurred better on MS medium supplemented with 0.5 μM 2,4-D either alone or in combination with 4.5 μM kinetin. Maximum shoot regeneration (78 %) was observed when calli, induced from ovaries of 4 mm size flower buds and proliferating on MS + 0.5 μM 2,4-D, were subcultured to MS medium containing 5 μM BAP. Histological analysis revealed that 4 mm sized flower bud corresponds to a 2-nucleate stage of embryo sac. The shoots were then multiplied by forced axillary branching on MS medium supplemented with 1.0 μM BAP and 250 mg dm -3 casein hydrolysate. The shoots could be rooted on ¼ strength MS medium supplemented with 0.5 μM indole-3-butyric acid (IBA) at a frequency of 79 %. Cytological analysis by root tip squash preparations revealed that all the plantlets were diploids. These plants were subsequently hardened and established in soil with transplantation rate of 81.8 %.Additional key words: adventitious shoot proliferation, auxins, callus culture, casein hydrolysate, cytokinins, embryo sac, histology, ovary culture. ⎯⎯⎯⎯Neem (Azadirachta indica A. Juss.), an evergreen tropical tree belonging to the family Meliaceae, has many important medicinal, agrochemical and economic uses. Due to highly heterozygous nature, long reproductive cycle and poor seed yield, improvement of neem by conventional methods is very limited. In this respect, tissue culture can play an important role. In vitro regeneration of neem from various vegetative tissues was published (Chaturvedi et al. 2004a, Rout 2005. Recently, some studies have described shoot regeneration from anthers/microspores (Chaturvedi et al. 2003a) and endosperm tissues (Chaturvedi et al. 2003b) of adult tree origin.Even though the main objective of the present study was to obtain haploid plants from the unfertilized ovary, regeneration of diploid plants indicated the potential use of this juvenile unfertilized ovary explant for large scale micropropagation. In contrast, the leaves, nodal and internodal segments from mature trees show recalcitrance due to accumulation of secondary metabolites.Unfertilized ovaries, obtained from closed flower buds of an adult 54-year-old neem tree, were used as explants. Ovaries were excised from flower buds of four sizes (2, 3, 4 and 5 mm) and the corresponding developmental stage of ovary was determined by paraffin sections. The flower buds were surface sterilized with 0.1 % (m/v) solution HgCl 2 for 7 min, followed by three washings in sterile-distilled-water. The ovaries were dissected out with the aid of a stereo-microscope (Nikon SMZ-645, Tokyo, Japan). Four ovaries were cultured in ⎯⎯⎯⎯

Caracterización morfo-anatómica de la embriogénesis somática secundaria en Azadirachta indica (Meliaceae)

“…The embryogenic callus and friable were found in the cotyledon segments, suggesting that the pericarp protects the cotyledon against some environmental factors or disinfection treatment. In addition, the abundant reserve substances from cotyledon tissue help the induction of embryogenic callus and whole plant regeneration (Gairi and Rashid, 2004;Thomas and Chaturdevi, 2008;Srivastava et al, 2009). Researchers who have worked with Meliaceae species suggested that somatic embryogenesis was obtained from certain pro-embryogenic cells without the presence of auxin in the culture medium, such as 2.4-Dichlorophenoxyacetic acid (Sharry and Teixeira, 2006).…”

Evaluación de un sistema de regeneración por embriogénesis somática de Neem (Azadirachta indica)

“…En relación a esto, Chaturvedi et al (2003), Rodrigues (2009), Srivastava et al (2009), Vila et al (2010, mencionan que en el caso de los cotiledones, la edad del explante condiciona la respuesta de los mismos y que la frecuencia de regeneración es mayor en cotiledones jóvenes o inmaduros ya que no crean asociación al embrión, sin embargo, señalan que la capacidad regenerativa de los mismos no varía en gran medida y que ésta siempre responde de manera positiva con frecuencias de regeneración satisfactorias (60 a 90 %), tal como lo reflejado en este trabajo, sin embargo, el porcentaje de regeneración de plantas está por debajo al reportado por Artigas y Fernández (2015) donde señalan una alta regeneración por embriogénesis somática primaria (96 %) y secundaria (71 %) utilizando secciones cotiledonares de A. indica. Esta respuesta regenerativa por embriogénesis somática primaria es similar a la reportada en otras meliáceas, tales como Melia azedarach con un 90,5 % (Deb, 2001) y Melia volkensii con un 100 % (Mulanda et al, 2014).…”

“…Varios autores (Chaturvedi et al, 2003;Thomas y Chaturvedi, 2008;Srivastava et al 2009), señalan que para diversas familias vegetales leñosas, entre ellas las Meliáceas, presentan problemas en cuanto a los procesos regenerativos, específicamente en el desarrollo de callos regenerativos, ya que normalmente, por la naturaleza de los tejidos y la condición genética de los mismos, se produce en mayor frecuencia la formación de órganos (raíces y hojas), a través de los cuales se dificulta la regeneración de plantas completas, sin embargo, se ha encontrado que en tejidos como el cotiledón, específicamente en las zonas celulares ricas en sustancias de reserva, se puede obtener callo regenerativo de tipo embriogénico y a partir de éste inducir la formación de embriones somáticos, a través de los cuales es posible la regeneración de plantas completas, lo que concuerda con el proceso establecido en este trabajo.…”

“…En el caso de los procesos regenerativos en esquejes, los resultados obtenidos en este trabajo difieren con los presentados por Salvi et al, (2001), Gairi y Rashid (2005a), Gairi y Rashid (2005b), quienes han logrado la regeneración con frecuencias relativamente buenas (40 a 70 %), aunado a esto, Martínez et al, (2001) han empleado esquejes de vitro-plantas, lo que supone una ventaja al momento del cultivo, pues no están sujetos a condiciones ambientales que puedan afectar su estado fisiológico. En este trabajo, la baja frecuencia de formación de callo, puede atribuirse a los procesos de contaminación endógena o también a la necrosis que presentaron los explantes, los cuales afectan directamente el desarrollo del mismo, tal como señalan Zypman et al, (2001) y Srivastava et al, (2009).…”

ESTABLECIMIENTO DEL SISTEMA DE REGENERACION POR EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE Azadirachta indica A. Juss.

“…Entre las diversas familias vegetales leñosas, la Meliaceae, presenta recalcitrancia al proceso regenerativo in vitro, específicamente en el desarrollo de callos embriogénicos, ya que normalmente, por la naturaleza de los tejidos y la condición genética de los mismos, se produce en mayor frecuencia la formación de callos organogénicos (raíces y hojas), a través de los cuales se dificulta la regeneración de plantas completas, sin embargo, se ha encontrado que en tejidos como el cotiledón, con abundante sustancias de reserva, se puede obtener callo regenerativo de tipo embriogénico y a partir de éste inducir la formación de embriones somáticos, a través de los cuales es posible la regeneración de plantas completas, lo que concuerda con el proceso establecido en este trabajo (Chaturvedi et al, 2003;Gairi y Rashid, 2004;Gairi y Rashid, 2005;Thomas y Chaturvedi, 2008;Srivastava et al, 2009). Por otra parte, Goralski et al, (2005) y Ranjan (2005) mencionan en A. indica, que una de las vías seguidas por este tipo de explante es la embriogénesis somática indirecta, evidenciando la formación de embriones sobre el callo regenerativo de tipo embriogénico, como se encontró en esta investigación, no obstante en otras meliáceas como Melia azedarach y Melia volkensii (Mulanda et al, 2014), la diferenciación de los embriones somáticos se presenta directamente del tejido embriogénico cigótico inmaduro y cotiledonar respectivamente.…”