Generation of Knockout Rats with X-Linked Severe Combined Immunodeficiency (X-SCID) Using Zinc-Finger Nucleases

Abstract

BackgroundAlthough the rat is extensively used as a laboratory model, the inability to utilize germ line-competent rat embryonic stem (ES) cells has been a major drawback for studies that aim to elucidate gene functions. Recently, zinc-finger nucleases (ZFNs) were successfully used to create genome-specific double-stranded breaks and thereby induce targeted gene mutations in a wide variety of organisms including plants, drosophila, zebrafish, etc.Methodology/Principal FindingsWe report here on ZFN-induced gene targeting of the rat interleukin 2 receptor gamma (Il2rg) locus, where orthologous human and mouse mutations cause X-linked severe combined immune deficiency (X-SCID). Co-injection of mRNAs encoding custom-designed ZFNs into the pronucleus of fertilized oocytes yielded genetically modified offspring at rates greater than 20%, which possessed a wide variety of deletion/insertion mutations. ZFN-modified founders faithfully transmitted their genetic changes to the next generation along with the severe combined immune deficiency phenotype.Conclusions and SignificanceThe efficient and rapid generation of gene knockout rats shows that using ZFN technology is a new strategy for creating gene-targeted rat models of human diseases. In addition, the X-SCID rats that were established in this study will be valuable in vivo tools for evaluating drug treatment or gene therapy as well as model systems for examining the treatment of xenotransplanted malignancies.

Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases

“…Here we show that Xenopus can be added to the growing list of important model animals for which ZFN-encoding mRNA has allowed facile reverse genetics, including Drosophila (7), zebrafish (22,27), and the rat (15,28). An important requirement for the use of ZFNs is a streamlined protocol to predict and implement effective gene disruption.…”

Neuroscience Research Using Non-human Primate Models and Genome Editing

“…Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas system are mainly used as engineered nucleases. A number of genetically modified animals have already been generated using such restriction enzymes (Bedell et al 2012;Geurts et al 2009;Hauschild et al 2011;Mashimo et al 2010;Ochiai et al 2010;Sung et al 2013;Suzuki et al 2013;Wang et al 2013;Yang et al 2013). Among these, the CRISPR/Cas system was developed the most recently and is particularly promising (Cong et al 2013;Mali et al 2013).…”

Une nouvelle ère pour la génétique du rat

“…Elle repose sur l'utilisation Contre toute attente, l'expression de nucléases artificielles dans les cellules embryonnaires aux premiers stades de développement n'est pas toxique et semble avoir une activité de cassure de l'ADN limitée à la séquence choisie par l'expérimentateur. En effet, l'examen des régions du génome qui présentent une séquence proche de celle reconnue par les nucléases à doigts de zinc utilisées n'a révélé jusqu'à présent aucune mutation [6][7][8]. De toute façon, dans l'hypothèse où de telles modifications non désirées surviendraient, elles seraient dans la plupart des cas rapidement perdues au cours des croisements nécessaires à l'établissement des lignées mutantes.…”

“…Dans cette première étude, 17 % des ratons nés à la suite de cette manipulation étaient porteurs d'altérations génétiques au niveau de sites de coupures situés dans le gène IgM, le gène Rab38 ou un transgène préa-lablement intégré dans le génome par transgenèse classique. Quelques mois plus tard, une deuxième étude confirmait ces résultats en ciblant le gène codant la chaîne  du récepteur de l'interleukine 2, et permettait l'obtention de rats présentant un déficit immunitaire combiné sévère et devenus tolérants à la greffe de cellules d'origine humaine [7].…”

“…L'efficacité est telle que parfois les deux allèles du gène ciblé sont simultanément modifiés dans les animaux fondateurs [6,8]. Il faut néanmoins garder à l'esprit que des modifications peuvent encore survenir plusieurs jours après l'injection et se retrouver ainsi à l'état mosaïque chez les animaux fondateurs [7,8]. Un deuxième atout de cette technique est qu'elle est applicable à toutes sortes de zygotes sous réserve que ceux-ci supportent la micro-injection.…”