Vanili merupakan salah satu tanaman rempah yang memiliki banyak manfaat, sehingga menyebabkan vanili mempunyai nilai ekonomi yang cukup tinggi. Selama ini tanaman vanili biasa diperbanyak secara vegetatif menggunakan stek batang, tetapi perbanyakan ini memiliki beberapa kelemahan sehingga diperlukan metode perbanyakan secara kultur jaringan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui interaksi antara macam media dengan ZPT, menentukan media dan konsentrasi ZPT yang paling tepat untuk mikrostek vanili. Penelitian dilaksanakan dengan menggunakan metode rancangan acak lengkap (RAL). Faktor pertama yaitu macam media yang terdiri dari media MS, media B5, dan media VW. Faktor kedua yaitu konsentrasi ZPT yang terdiri dari IAA 0,5 + kinetin 1 ppm, IAA 1,0 + kinetin 2 ppm, dan IAA 1,5 + kinetin 3 ppm. Data dianalisis dengan menggunakan analisis sidik ragam pada taraf nyata 5% dan diuji lanjut dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat interaksi antara perlakuan macam media dan konsentrasi IAA dan kinetin terhadap parameter saat tumbuh tunas dan panjang akar. Kombinasi perlakuan M1Z3 memberikan hasil paling baik pada parameter saat tumbuh tunas, sedangkan kombinasi perlakuan M1Z2 memberikan hasil paling baik pada parameter panjang akar. Media MS dan media B5 memberikan respon yang lebih baik pada semua parameter dalam pertumbuhan mikrostek vanili secara in vitro. Pemberian IAA + kinetin pada semua konsentrasi memberikan respon yang sama, kecuali pada parameter bobot kering dalam pertumbuhan mikrostek vanili secara in vitro.