Dosagem de cortisol e cortisona livres urinários empregando cromatografia líquida associada a espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS)

Abstract

A dosagem de cortisol livre na urina (CLU) é um método útil na triagem de pacientes suspeitos de síndrome de Cushing. Os imunoensaios atuais apresentam limitações que dificultam sua aplicação e a comparação de resultados por diferentes ensaios. No presente método para dosagem de cortisol e cortisona livres urinários, baseado em cromatografia líquida com detecção por espectrômetro de massa em tandem (LC-MS/MS), uma alíquota de urina 24h (200µL) é misturada com solução contendo quantidade conhecida de cortisol deuterado e extraída on-line em fase sólida (C 18 ). O eluato é transferido para uma segunda coluna C 18 (Phenomenex Luna, 3µ, de 50 x 2mm), e o eluato obtido em modo isocrático é aplicado diretamente no MS/MS modelo Quattro Micro, operando no modo positivo de ionização química a pressão atmosférica (APCI). Todo o processo é automatizado e a quantificação é feita por diluição isotópica com base nas razões das áreas dos picos dos analitos e do padrão interno deuterado. O estudo de especificidade mostrou que nenhum esteróide testado apresenta reatividade cruzada superior a 1% com cortisol ou cortisona. A sensibilidade funcional é <1µg/L para os dois esteróides, e o CV interensaio <8%. Os estudos de recuperação e de linearidade foram satisfatórios, e a comparação entre os resultados obtidos para cortisol em 98 amostras de rotina, pelo ensaio em estudo e por um RIE, mostraram correlação de r= 0,838, sendo os valores obtidos por LC-MS/MS significativamente mais baixos (medianas de 22,0 e 49,4µg/24h, respectivamente) (P<0,0001). Os valores de referência para cortisol foram definidos entre 11 e 43µg/24h, compatíveis com métodos semelhantes recentemente descritos. A dosagem concomitante de cortisona livre urinária permite o estudo da atividade da enzima 11β-HSD2 e a pesquisa da síndrome do excesso aparente de mineralocorticóides. O método descrito representa a primeira descrição, em nosso meio, de uma nova geração de métodos para a medida de esteróides hormonais, baseados em processos preparativos automatizados e leitura por espectrometria de massa em tandem. Free urinary cortisol (UFF) measurement is one of the most useful screening tests for Cushing's syndrome. Immunoassays employed today by most clinical laboratories present limitations, specially concerning specificity. These limitations restrain a widespread application of the method, as well as the comparison of results obtained by the use of different methods. We present the development and characterization of a UFF and cortisone method based on liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). A 200µL aliquot from a 24h urine sample

11β-hydroxysteroid dehydrogenase type-2 and type-1 (11β-HSD2 and 11β-HSD1) and 5β-reductase activities in the pathogenia of essential hypertension

“…3). Even though there was a linear regression, cortisol concentrations obtained by HPLC-MS/MS were lower than those obtained by RIA as previously described by others [41][42][43]. Additionally, comparison of these two methods by Bland-Altman analysis [44] showed a confidence interval for the average of the differences with an upper limit of 53.8 (CI 95% 49.32; 58.32) and a lower limit of 1.4 (CI 95% -3.13; 5.87).…”

Simultaneous quantitation of seven endogenous C-21 adrenal steroids by liquid chromatography tandem mass spectrometry in human serum

“…Liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) is being rapidly introduced as a better alternative to quantify steroids in the clinical context. Methods have been described for the determination of cortisol and cortisone [9,10], 17-hydroxyprogesterone [3], 11-desoxycortisol [11,12], 21-desoxycortisol [13] and corticosterone [14]. Some of them still demand manual sample preparation procedures such as liquid-liquid extraction [13,14] or off-line solid-phase extraction [3,12].…”

Determination of cortisol and cortisone in human saliva by a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method

“…In the case in urine, the presence of several endogenous interfering steroids, in special cortisol metabolites, demands extraction and chromatography in order to achieve the necessary specificity (13-15). The introduction of tech-niques based in liquid chromatography associated with tandem mass spectrometry for the measurement of free urinary cortisol were a definitive step forward in the improvement of the general characteristics of the assays (16,17), and additionally provided the opportunity to measure concomitantly free cortisone levels.…”