Detection of Mycobacterium bovis in Bovine and Bubaline Tissues Using Nested-PCR for TbD1

Abstract

In the present study, a nested-PCR system, targeting the TbD1 region, involving the performance of conventional PCR followed by real-time PCR, was developed to detect Mycobacterium bovis in bovine/bubaline tissue homogenates. The sensitivity and specificity of the reactions were assessed with DNA samples extracted from tuberculous and non-tuberculous mycobacteria, as well as other actinomycetales species and DNA samples extracted directly from bovine and bubaline tissue homogenates. In terms of analytical sensitivity, the DNA of M. bovis AN5 was detected up to 1.56 ng with conventional PCR, 97.6 pg with real-time PCR, and 1.53 pg with nested-PCR in the reaction mixture. The nested-PCR exhibited 100% analytical specificity for M. bovis when tested with the DNA of reference strains of environmental mycobacteria and closely-related Actinomycetales. A clinical sensitivity value of 76.0% was detected with tissue samples from animals that exhibited positive results in the comparative intradermal tuberculin test (CITT), as well as from those with lesions compatible with tuberculosis (LCT) that rendered positive cultures. A clinical specificity value of 100% was detected with tissue samples from animals with CITT- results, with no visible lesions (NVL) and negative cultures. No significant differences were found between the nested-PCR and culture in terms of detecting CITT+ animals with LCT or with NVL. No significant differences were recorded in the detection of CITT- animals with NVL. However, nested-PCR detected a significantly higher number of positive animals than the culture in the group of animals exhibiting LCT with no previous records of CITT. The use of the nested-PCR assay to detect M. bovis in tissue homogenates provided a rapid diagnosis of bovine and bubaline tuberculosis.

Identificação e genotipagem de Mycobacterium bovis em bovinos positivos no teste intradérmico para tuberculose em Mato Grosso do Sul

“…Há relatos de M. tuberculosis infectando bovinos (Ameni et al 2011, Mbugi et al 2012, Romero et al 2011, Thakur et al 2012. Entretanto, no Brasil, mais de 2000 culturas de lesões presuntivas de tuberculose bovina foram testadas para M. tuberculosis em laboratório de referência do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e não houve resultados positivos para esta espécie (Araújo et al 2014). De qualquer modo, os benefícios da PCR baseada nessa sequência de 500 pb não podem ser menosprezados, uma vez que a amplificação é indicativa da presença do agente infeccioso causador da tuberculose bovina (Rodrí-guez et al 1999).…”

Diagnóstico histopatológico e molecular de lesões sugestivas de tuberculose em búfalos abatidos nos municípios de Macapá e Santana, estado do Amapá

“…Estes resultados se assemelham aos obtidos por Araújo et al (2014b), nos quais a detecção direta de M. bovis em lesões sugestivas de tuberculose em bovinos e bubalinos, previamente reagentes ao teste tuberculínico intradérmico comparativo, alcançou sensibilidade clínica de 76% e especificidade de 100%. Em outro estudo, a identificação do CMT em tecidos bovinos e bubalinos, por meio de Nested-PCR, alcançou sensibilidade clínica de 76,7% e especificidade máxima (100%), índices superiores à PCR convencional e cultura (Araújo et al 2014a).…”

“…(Sulieman & Hamid 2002), Streptococcus spp., ou serem decorrentes de micobacterioses atípicas, capazes de interferir em sistemas de PCR pouco sensíveis (Sahraoui et al 2009, Thacker et al 2011. Outra possibilidade seria a falha de sensibilidade das técnicas de Nested-PCR, uma vez que o diagnóstico diretamente em tecidos tem apresentado sensibilidade clínica média de até 75% (Araújo et al 2014a, Araújo et al 2014b.…”

“…Para Mycobacterium bovis, foram empregados primers e sondas para a região TbD1, segundo Araújo et al (2014b). Esta região compreende o gene mmpS6, que codifica para uma provável proteína conservada de membrana, e a região 5' do gene mmpL6.…”

“…Inicialmente, foram feitas amplificações dos dois alvos citados por PCR convencional. Em seguida, realizou-se PCR em tempo real, utilizando-se os produtos das reações de PCR convencional como molde, e primers e sondas delimitando um produto menor, segundo Araújo et al (2014a) e Araújo et al (2014b).…”