Comparison of an ELISA assay for the detection of adhesive/invasive Neospora caninum tachyzoites

Abstract

Neospora caninum belongs to the phylum Apicomplexa, the causative agent of neosporosis, which leads to economic impacts on cattle production. A common feature among apicomplexan parasites is the invasive process driven mostly by the parasite. As a first evaluation of candidate molecules that play a possible role by interfering in this invasive process, the in vitro invasion assay is a fast and direct way to screen future agonists or antagonists. This work involved the development of a new cell culture ELISA and transient β-galactosidase activity applied to the semi-quantitative detection of N. caninum in Vero cell culture. Cell culture ELISA is based on histochemistry and immunology, resulting in a colorimetric reaction. The β-galactosidase activity was obtained by the transient transfection of the lacZ gene under control of RPS13 promoter of N. caninum. These methods were used to evaluate the effects of temperature (37°C and 85°C) on the invasion and adhesion of tachyzoites. The three tested methods (real time PCR, β-galactosidase activity and ELISA) showed a similar pattern, indicating that different methods may be complementary.Keywords: Neospora caninum, cell culture ELISA, LacZ gene, transfection, real-time PCR, invasion assay. ResumoNeospora caninum, parasita do filo Apicomplexa, é causador da neosporose, doença responsável por perdas econômicas importantes na pecuária. Um fator comum entre os apicomplexas é o processo de invasão majoritariamente dirigido pelo parasita. Dentre as primeiras avaliações de moléculas candidatas, que possivelmente interferem no processo de invasão, o ensaio de invasão in vitro é um meio rápido e direto de selecionar futuros agonistas ou antagonistas. Este trabalho desenvolveu um novo ELISA baseado em cultura (Cell-culture ELISA) e um ensaio que mede a atividade transiente de β-galactosidase, aplicados para a detecção semiquantitativa de N. caninum em células Vero. Cell-culture ELISA é baseado em histoquímica e imunologia, resultando em uma reação colorimétrica. A atividade da β-galactosidase foi obtida pela transfecção transiente do gene LacZ sob controle do promotor RPS13 de N. caninum. Esses métodos avaliaram os efeitos da temperatura (37°C e 85°C) sobre a invasão e adesão. Os três métodos testados (real time PCR, atividade de β-galactosidase e ELISA) mostraram um padrão similar, indicando que diferentes métodos podem ser complementares. Adicionalmente, esse ELISA é adequado para aplicação em laboratórios carentes de uma complexa estrutura para métodos de detecção moleculares.Palavras-chave: Neospora caninum, cell-culture ELISA, gene LacZ, transfecção, PCR em tempo real, ensaio de invasão.