RESUMO-O aleitamento artificial fracionado tem permitido fornecer quantidade adequada de leite aos bezerros nas primeiras semanas de vida e restringir na desmama, estimulando o melhor crescimento e adaptação a dietas com volumosos e concentrados. Objetivou-se avaliar as características ruminais e a microbiota gastrointestinal de bezerros leiteiros em diferentes sistemas de aleitamento. Foram utilizados 12 bezerros Holandeses, distribuídos aleatoriamente em dois tratamentos. No aleitamento convencional, foram fornecidos quatro litros de leite diários; no fracionado, seis litros do 6° ao 25° dia, quatro litros do 26° ao 45° e dois litros por dia do 46° ao 60° dia. Ao final do período experimental, os animais foram eutanasiados e aproximadamente 15 mL dos conteúdos do rúmen, abomaso e intestino foram coletados para análises físicas, químicas e microbiológicas para detecção de Enterobacteriaceae, fungos e protozoários. Os sistemas de aleitamento não influenciaram nas características de cor, odor e viscosidade do líquido ruminal. O pH e a quantificação de protozoários, Enterobacteriaceae, fungos micelianos e leveduriformes não apresentaram diferença significativa entre os tratamentos, nos diferentes sítios avaliados. Os gêneros Escherichia e Proteus foram os mais frequentes entre as amostras dos conteúdos avaliados, para ambos os sistemas de aleitamento. Entretanto, E. coli foi significativamente mais frequente entre os isolados provenientes do fluido ruminal de bezerros em aleitamento convencional, o que poderia sugerir um desequilíbrio nesse ecossistema. Dessa forma constatou-se que os sistemas de aleitamentos influenciaram o perfil de gêneros de Enterobacteriaceae no rúmen e intestinos dos bezerros.