Influência de desproteinizantes ácidos na quantificação da glutationa reduzida eritrocitária por CLAE-UV

Abstract

INFLUENCE OF DEPROTEINIZING ACIDS IN ERYTHROCYTIC REDUCED GLUTATHIONE QUANTIFICATION BY HPLC-UV. Large differences in reduced glutathione (GSH) levels have been found in different investigations, also in healthy people. GSH oxidation in vitro has been associated with sample acidification in the presence of oxihemoglobin. In this work, the influence of different acids on GSH determination utilizing HPLC with UV detection was evaluated. The results showed that metaphosphoric acid and sulfosalicylic acid were inadequate for analysis, because metaphosphoric acid showed to be inefficient for deproteinization and with sulfosalicylic acid loss of GSH was observed. Trichloroacetic acid did not effect GSH quantification, since the deproteinized form was immediately derivatized with 5, 5´-dithio-bis (2-nitrobenzoic) acid. Methods with TCA deproteinization presented linear results from 0.5 to 3.0 mM. The correlation coefficient between aqueous curves and GSH spiked RBC exceeded 0.99. Precision calculations showed CV lower than 10% and bias within ± 10% for concentrations of 0.5; 1.5 and 3.0 mM GSH. The recovery was higher than 94%. Moreover, GSH blood concentrations were independent of hemoglobin concentrations.Keywords: GSH; erythrocytes; deproteinizing acids. INTRODUÇÃOA glutationa, um tripeptídeo contendo cisteína, desempenha importantes funções em células humanas, especialmente como agente antioxidante. A forma reduzida da glutationa (GSH) mantém os grupos tióis (-SH) das proteínas, reduz ligações dissulfetos (-S-S-) induzidas pelo estresse oxidativo, neutraliza radicais livres e detoxifica eletrófilos 1,2 . Por isso, a concentração intracelular da GSH é um indicador da capacidade da célula em manter sua homeostase, através da neutralização de agentes oxidantes. Na presença de peróxidos, a GSH intracelular é convertida a glutationa oxidada (GSSG) pela glutationa peroxidase, a qual catalisa a redução destes peróxidos 3 . A redução da GSSG a GSH é mediada pela enzima glutationa redutase, cujo substrato é o NADPH 3 . A glicose-6-fosfato desidrogenase, como fonte de NADPH, garante a redução da GSSG e a manutenção de uma constante da reserva de GSH, especialmente no eritrócito 4 . O nível de glutationa em eritrócitos está principalmente em sua forma reduzida (99,5%) e a concentração de GSSG em eritrócitos é descrita como baixa porque esta atravessa facilmente a membrana celular 5 . Na avaliação do estresse oxidativo, o uso de eritrócitos é aconselhável, pois durante seu ciclo vital entram em contato com as mais diversas estruturas orgânicas. Os eritrócitos perfazem 40% do volume do sangue e as espécies reativas do oxigênio que saem da célula vermelha têm potencial para causar dano a outros componentes celulares. Em contrapartida, a GSH em eritrócitos é responsável pela homeostase contra o dano oxidativo da própria célula, bem como de todas as outras células do organismo 6 . Um método de referência para determinação de GSH ainda não foi definido 7,8 . No decorrer dos anos, vários métodos foram introduzidos para determinação ...

Efeitos da administração orogástrica de s-nitrosotióis e avaliação cinética da propensão e resistência à obsidade induzida por dieta

“…As amostras de sangue foram centrifugadas como descrito acima para a separação do plasma. O plasma foi desproteinizado pela adição de 100 µL de TCA 200 mmol L -1 à 400 µL de plasma, seguido de centrifugação por 10 min, a 4 ºC, 11000 rpm (Schott 2007). O sobrenadante foi retirado, filtrado com filtros para seringa 0,2 µm (Millipore) e injetado no UPLC, segundo as condições descritas acima.…”