Mutants of common bean alpha-amylase inhibitor-2 as an approach to investigate binding specificity to alpha-amylases

Abstract

-Despite the presence of a family of defense proteins, Phaseolus vulgaris can be attacked by bruchid insects resulting in serious damage to stored grains. The two distinct active forms of α-amylase inhibitors, α-AI1 and α-AI2, in P. vulgaris show different specificity toward α-amylases. Zabrotes subfasciatus α-amylase is inhibited by α-AI2 but not by α-AI1. In contrast, porcine α-amylase is inhibited by α-AI1 but not by α-AI2. The objective of this work was to understand the molecular basis of the specificity of two inhibitors in P. vulgaris (α-AI1 and α-AI2) in relation to α-amylases. Mutants of α-AI2 were made and expressed in tobacco plants. The results showed that all the α-AI2 mutant inhibitors lost their activity against the insect α-amylases but none exhibited activity toward the mammalian α-amylase. The replacement of His33 of α-AI2 with the α-AI1-like sequence Ser-Tyr-Asn abolished inhibition of Z. subfasciatus α-amylase. From structural modeling, the conclusion is that the size and complexity of the amylase-inhibitor interface explain why mutation of the N-terminal loop and resultant abolition of Z. subfasciatus α-amylase inhibition are not accompanied by gain of inhibitory activity against porcine α-amylase.Index terms: Phaseolus vulgaris, α-amylase inhibitors, inhibitor specificity, site directed mutagenesis, structural modeling. Mutantes do inibidor-2 de alfa-amilase do feijão-comum para investigação da especificidade de ligação a alfa-amilasesResumo -Apesar de possuir uma família de proteínas de defesa, o feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) pode ser atacado por insetos bruquídeos causando sérios danos aos grãos armazenados. O P. vulgaris possui duas formas ativas de inibidores de α-amilases, denominadas α-AI1 e α-AI2, que apresentam diferentes especificidades em relação às α-amilases. A α-amilase de Zabrotes subfasciatus é inibida por α-AI2 mas não por α-AI1. Em contraste, a α-amilase pancreática de porco é inibida por α-AI1 mas não é por α-AI2. O objetivo deste trabalho foi entender as bases moleculares da especificidade desses inibidores em relação às α-amilases. Para tanto, foram construídos mutantes do α-AI2, os quais foram expressados em plantas de fumo. Todos os inibidores mutantes deixaram de inibir a α-amilase de inseto sem, contudo, passar a exibir atividade contra a α-amilase de mamífero. Os modelos estruturais explicam por que a substituição de His33 do α-AI2 pela seqüência correspondente do α-AI1 (Ser-Tyr-Asn) aboliu a inibição da α-amilase de Z. subfasciatus. Dos estudos de modelagem molecular pode-se concluir que o tamanho e a complexidade da interface α-amilase-inibidor explicam por que a mutação da alça N-terminal e a quebra da atividade inibitória para α-amilase de Z. subfasciatus não levam ao ganho de atividade inibitória do mutante em relação à α-amilase de porco.Termos para indexação: Phaseolus vulgaris, inibidores de α-amilases, especificidade de interação, mutagênese sítio-dirigida, modelagem molecular.

Solution structure of the plant defensin VrD1 from mung bean and its possible role in insecticidal activity against bruchids

“…α‐AI2 is also shorter than α‐AI1 in the N‐terminal loop by two residues (residues 31–40 in α‐AI1 versus 31–38 in α‐AI2). Da Silva et al48, 49 showed that the insertion of the two residues into the N‐terminal loop of α‐AI2 (replace residue His 33 with Ser‐Tyr‐Asn) abolished inhibitory activity against ZSA. These observations suggest that loop L2 of plant defensins is significant in α‐amylase inhibitory activity.…”

Untitled

“…The α-amylase activity was measured using the dinitrosalicylic acid (DNS) method [16,17] developed by Bernfeld (1955), improved by Jamieson et al (1969), and adopted for testing α-amylase inhibitory potential [18] using 1% soluble starch as substrate. The test substance was pre-incubated with amylase (100 µL) at room temperature for 20 min before the addition of 100 µL of the substrate solution followed by incubation at 37°C for 10 min.…”