RAPD em Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke): adaptação do método para coleta de amostras in situ, ajuste das condições de PCR e apresentação de um processo para selecionar bandas reprodutíveis

Abstract

O Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) é uma espécie importante economicamente para a Região Amazônica, porque sua madeira é fonte de linalol, insumo utilizado pelas perfumarias. Esta espécie foi explorada durante décadas e, ainda assim, o conhecimento acerca da diversidade genética intra-específica é muito restrito. Foram objetivos deste trabalho: 1) validar um protocolo para coleta de folhas de pau-rosa que permitisse preservar a integridade do DNA até a estocagem em "freezer"; 2) selecionar um protocolo para extração de DNA em quantidade e qualidade adequadas para geração de bandas RAPD e 3) desenvolver um critério para avaliar o grau de reprodutibilidade que pudesse auxiliar a seleção de bandas RAPD úteis para análises de diversidade genética. Imediatamente após a coleta, as folhas foram acondicionadas em tubos de polietileno com sílica gel e aí permaneceram por até 10 dias. Foram testados três protocolos para a extração de ácidos nucléicos destas folhas, condições ideais para as PCR e a reprodutibilidade dos padrões RAPD. Critérios para a eliminação das bandas que mais contribuíram para o afastamento dos resultados do ideal da reprodutibilidade total foram desenvolvidos e a significância estatística das diferenças geradas pela aplicação dos critérios ao conjunto de dados foi testada. DNA com qualidade e em quantidade suficiente para a geração de padrões RAPD, nas condições ideais definidas para as PCRs, foi obtido. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 70% não diferiu do controle. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 90% diferiu dos demais tratamentos em todos os arranjos testados (P < 5%).

Geographic pattern of genetic diversity in natural populations of Rosewood (Aniba rosaeodora), in the Central Amazonia

“…the PCR reactions included 30 ng of Dna, 2.50 u of Taq Dna polymerase, 3.0 mm of mgCl 2 , 500 nm of primer, 100 µm of each dntP and 0.1% BSa for a final volume of 25 µl, and were optimized for Rosewood by Santos et al (2007). PCR was carried out in a Perkin elmer gene amp PCR System 2400 thermal cycler, programmed for one cycle of 1 minute at 90 o C followed by 35 cycles of 1 min at 92 o C, 2 min at 30 o C and 1 minute at 72 o C, with an annealing temperature of 35 o C and a final cycle of 5 min at 72 o C and 4 o C until processing.…”

“…RaPD patterns were visualized under uv light and captured with a Kodak Digital Zoom Camera photo-documentation system and accessory software (Kodak Digital Science DC120 Kit gel Documentation accessory Kit and 1D image analysis Software). only reliable markers with reproducibility index above 80% were included in the analysis (Santos et al, 2007).…”

“…matrix correlations for geographic distance, genetic distance (nei, 1978) and gene flow were calculated by mantel's test (mantel, 1967), using tFPga with 1000 permutations. results a total of 51 RaPD markers were scored, of which 35 were used cause they presented better reproducibility, above 80% (Santos et al, 2007). thirty-two of these bands were polymorphic (91.4%).…”

“…Sampling error can be reduced further by using a large and reliable set of loci (nei, 1987). Considering the procedures used to evaluate marker consistency and reproducibility (lynch & milligan, 1994;Perez et al, 1998;Santos et al, 2007), the 32 RaPD loci are sufficient for the current study.…”

Genetic diversity in rosewood saplings (Aniba rosaeodora ducke, Lauraceae): an ecological approach

“…Only those exhibiting 80% or more of reproducibility were scored (following Santos et al 2007). The RAPD reactions were performed in a 25 µL volume containing 30 ng of DNA, 2.5 U of Taq DNA polymerase, 3.0 mM of MgCl 2 , 500 nM of primer, 100 µM of each dNTP and BSA (0.1%).…”