RESUMOObjetivos: estimar a prevalência e investigar os fatores de riscos associados à infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) em profissionais de enfermagem de um hospital universitário. Método: estudo descritivo, realizado num hospital público, localizado em Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil. Entre 2011 e 2012, 275 profissionais de enfermagem, incluindo enfermeiros (n=40), técnicos (n=113) e auxiliares de enfermagem (n=122) foram entrevistados e submetidos à coleta de sangue para detecção dos marcadores sorológicos da infecção pelo HBV, pelo Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA). Estudo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa, protocolo nº 2154/2011. Resultados: a prevalência global para infecção pelo HBV foi de 11,6% (IC: 95%: 0,1-0,6). A presença do marcador anti-HB isolado, que sugere imunidade vacinal, foi detectada em 63,7% dos participantes. Conclusão: percebeu-se a necessidade da implantação de estratégias eficientes para o delineamento de ações diagnósticas, educativas, profiláticas e assistenciais visando à prevenção e controle da infecção pelo HBV nestes profissionais. Palavras-chave: Saúde do trabalhador; fatores de risco; vacinas contra hepatite B; marcadores biológicos.