Objetivo: Avaliar os efeitos antimicrobiano e antibiofilme, e a citotoxicidade de uma nova pasta de hidróxido de cálcio (HC) associada ao óleo essencial de Melaleuca alternifolia (MA), em diferentes concentrações. Materiais e Métodos: As seguintes medicações compuseram os grupos experimentais: G1) HC/MA 1%; G2) HC/MA 5%; G3) HC/MA 10%; G4) HC/MA 20%; e G5) HC/propilenoglicol (PG). Solução salina 0,85% e meio DMEM serviram como controle nos testes antimicrobianos e de citotoxidade em fibroblastos do ligamento periodontal humano (FbLP), respectivamente. A atividade antimicrobiana foi avaliada por meio do teste de difusão em ágar. O efeito antibiofilme imediato das medicações foi avaliado por meio do teste de viabilidade bacteriana em biofilmes de 72 h de E. faecalis, formados sobre discos de dentina e tratados por sete dias com as medicações. Após a coleta microbiológica do biofilme remanescente, os discos de dentina foram imersos em meio estéril e armazenados por mais sete dias, para a análise do efeito antibiofilme residual das medicações, quando nova coleta microbiológica foi realizada. A atividade metabólica de FbLP foi avaliada por meio do ensaio colorimétrico MTS. Os valores médios dos halos de inibição, em mm, das unidades formadoras de colônia, e o percentual de atividade metabólica celular foram analisados pelos testes Kruskal-Wallis e post hoc Dunn (α = 5%). Resultados: Todas as medicações experimentais apresentaram superior ação antimicrobiana e antibiofilme comparadas ao controle, solução salina (P < 0,05), e mantiveram viáveis os FbLP, semelhante ao controle DMEM (P > 0,05). Conclusões: A pasta de hidróxido de cálcio associada ao óleo essencial de Melaleuca alternifolia possui excelente ação antimicrobiana, sendo capaz de erradicar o biofilme intracanal de E. faecalis, além de ser biocompatível com fibroblastos humanos.