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The objective of this study was to determine if the genetic diversity of eastern hemlock (Tsuga canadensis (L.) Carrière) is uniformly distributed or structured. Such information is relevant to help guide conservation efforts. Individuals were sampled in 60 range-wide populations of T. canadensis and genotyped at seven polymorphic chloroplast DNA loci. All 16 chlorotypes identified in T. canadensis were highly divergent from the unique chlorotype detected in Carolina hemlock (Tsuga caroliniana Engelm.). Among-population differentiation in T. canadensis was low (GST = 0.020) and the distribution of chlorotypes did not show any strong geographical pattern, which is likely due to the homogenizing effect of pollen gene flow during the Holocene. Nevertheless, a spatial Bayesian approach revealed two distinct groups of populations. Furthermore, an analysis of relative genetic distances indicated that southeastern Appalachian populations harboured greater population differentiation while conserving relatively high allelic richness, which might represent the imprint of an ancient glacial refugium in the region. Thus, these distinctive genetic patterns and the risk of Tsuga decline following climate warming combined with the introduction of the insect Adelges tsugae (Annand) indicate that the southern part of the range should be considered of high priority for ex situ conservation.Résumé : Le but de cette étude était de déterminer si la diversité génétique de la pruche du Canada (Tsuga canadensis (L.) Carrière) était uniforme ou structurée, une information pertinente pour guider les efforts de conservation. Des individus ont été échantillonnés dans 60 populations couvrant l'ensemble de l'aire de distribution de l'espèce et génotypés à sept loci d'ADN chloroplastique polymorphes. Les 16 chlorotypes identifiés chez T. canadensis étaient très divergents de l'unique chlorotype détecté chez la pruche de la Caroline (Tsuga caroliniana Engelm.). La différenciation de populations chez T. canadensis était faible (GST = 0,020) et la distribution des chlorotypes ne montrait pas de patron géographique marqué, probablement en raison de l'homogénéisation par le flux pollinique durant l'Holocène. Néanmoins, une analyse spatiale bayésienne a mis en évidence deux groupes distincts de populations. Aussi, l'analyse des distances génétiques relatives entre populations a révélé que les populations du sud-est des Appalaches étaient fortement différenciées et possédaient une forte richesse allélique, ce qui pourrait représenter l'empreinte d'un ancien refuge glaciaire dans cette région. Ces patrons distinctifs de variation ainsi que les risques élevés d'un déclin de Tsuga résultant du réchauffement climatique et de l'introduction de l'insecte Adelges tsugae (Annand) confèrent donc à la partie sud de l'aire de distribution une forte priorité de conservation ex situ.