The objective of this study was to evaluate the quality of bovine frozen-thawed sperm cells after Percoll gradient centrifugation. Frozen semen doses were obtained from six bulls of different breeds, including three taurine and three Zebu animals. Four ejaculates per bull were evaluated before and after discontinuous Percoll gradient centrifugation. Sperm motility was assessed by computer-assisted semen analysis and the integrity of the plasma and acrosomal membranes, as well as mitochondrial function, were evaluated using a combination of fluorescent probes propidium iodide, fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin and 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide. The procedure of Percoll gradient centrifugation increased the percentage of total and progressive sperm motility, beat frequency, rectilinear motility, linearity and rapidly moving cells. In addition, the percentage of cells with intact plasma membrane and mitochondrial membrane potential was increased in post-centrifugation samples. However, the percentage of sperm cells with intact acrosomal membrane was markedly reduced. The method used selected the motile cells with intact plasma membrane and higher mitochondrial functionality in frozen-thawed bull semen, but processing, centrifugation and/or the Percoll medium caused damage to the acrosomal membrane.

The effectiveness of induction of the acrosome reaction (AR) test as a parameter to in vitro estimate embryo production (IVP) in Nelore breed and the AR pattern by the Trypan Blue/Giemsa (TB) stain were evaluated. Frozen semen samples from ten Nelore bulls were submitted to AR induction and were also evaluated for cleavage and blastocyst rates. The treatments utilized for AR induction were: control (TALP medium), TH (TALP medium + 10μg heparin), TL (TALP medium + 100μg lysophosphatidylcholine) and THL (TALP medium + 10μg heparin + 100μg lysophosphatidylcholine). Sperm acrosomal status and viability were evaluated by TB staining at 0 and after 4h incubation at 38°C. The results obtained for AR presented a significant difference (P<0.05) in the percentage of acrosome reacted live sperm after 4h of incubation in the treatments that received heparin. The cleavage and blastocyst rates were 60% and 38% respectively and a significant difference was observed among bulls (P<0.05). It was founded a satisfactory model to estimate the cleavage and blastocyst rates by AR induction test. Therefore, it can be concluded that the induction of the AR test is a valuable tool to predict the IVP in Nelore breed.Keywords: cattle, fertility, semen, acrosome reaction, fertilization Palavras-chave: bovino, fertilidade, sêmen, reação acrossomal, fertilização RESUMO Avaliou-se a eficiência da técnica de indução da reação acrossomal (RA) como parâmetro para estimar a produção in vitro (PIV) de embriões Nelore e analisou-se o padrão de RA pela técnica de coloração Azul de Tripan/Giemsa (TB). Amostras de sêmen congelado de dez touros foram submetidas à indução da RA e avaliadas quanto a taxa de clivagem e blastocisto. Os tratamentos utilizados para indução da RA foram: controle (meio TALP), TH (meio TALP + 10μg heparina), TL (meio TALP + 100μg lisofosfatidilcolina) e THL (meio TALP + 10μg heparina + 100μg lisofosfatidilcolina

Comparative validation using quantitative real-time PCR (qPCR) and conventional PCR of bovine semen centrifuged in continuous density gradient [Validação comparativa utilizando PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ABSTRACTThe objective of the present study was to determine the sperm enrichment with X-bearing spermatozoa, after one centrifugation in a Percoll or OptiPrep continuous density gradient, using quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) of sperm DNA and resultant in vitro-produced bovine embryos by PCR. Frozen/thawed sperm was layered on density gradients and the tubes were centrifuged. Supernatants were gently aspirated and the sperm recovered from the bottom of the tubes. Cleavage and blastocyst rates were determined through in vitro production of embryos and PCR was performed to identify the embryos' genetic sex. A difference in blastocyst rate was found in the Percoll treatment compared to OptiPrep (P<0.05). The percentage of female embryos in the Percoll and OptiPrep groups was 62.0% and 47.1%, respectively. These results were confirmed by qPCR of spermatozoa DNA and underestimation was seen only in the Percoll group. It was possible to sexing sperm using simple approach.

Resumo:Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de gradientes de densidade contínuos de Percoll e OptiPrep para a separação de espermatozoides portadores do cromossomo X, e avaliar a influência sobre a viabilidade espermática, taxa de prenhez e proporção do sexo. Para isso, 100 milhões de espermatozoides foram depositados em cada tubo contendo o gradiente de densidade, previamente preparados, em tubos de poliestireno, 24 horas antes da centrifugação e mantidos a 4 °C. Centrifugou-se a 500 x g por 15 minutos a 22 °C e, posteriormente, os sobrenadantes foram aspirados e os espermatozoides recuperados no fundo dos tubos. Uma amostra foi avaliada antes a após a centrifugação para verificação da motilidade e vigor espermático. Os espermatozoides foram utilizados para a inseminação artificial em tempo fixo. Os resultados indicaram que a centrifugação não afetou a viabilidade espermática e a taxa de prenhez, entretanto não houve desvio da proporção do sexo para fêmeas. Mais estudos são necessários para determinar a necessidade de adaptação da técnica de centrifugação para a espécie ovina e assim obter o desvio da proporção do sexo como na espécie bovina. Palavras-chave: carneiro; sêmen; sexagem; viabilidade espermática. Abstract:The objective of this study was to evaluate the efficiency of continuous density gradients of Percoll and OptiPrep for separation of X-bearing sperm, and assess the influence on sperm viability, pregnancy rate and sex ratio. With this purpose 100 million spermatozoa were deposited into each tube containing density gradient, which were previously prepared in polystyrene tubes, 24 hours

RESUMOEmbriões bovinos produzidos in vitro, em estádio de mórula, foram cultivados em meio contendo anticorpos anti H-Y de alto título proveniente de ratos por 24h e, após este tempo, classificados em dois grupos: 1) embriões inibidos em estádio de mórula (classificados como machos) e 2) embriões que se desenvolveram e formaram a blastocele (classificados como fêmeas). O sexo de 311 embriões, distribuídos em três grupos de concentração dos anticorpos, 3%, 5% ou 7%, foi identificado pela reação em cadeia da polimerase. Não houve desvio da proporção entre machos e fêmeas (P>0,05) nos grupos em que se utilizaram os anticorpos anti H-Y, quando comparadas ao grupo-controle, sem adição de anticorpos anti H-Y. Diferentemente dos resultados obtidos utilizando-se embriões bovinos produzidos in vivo, a sexagem com anticorpos anti H-Y de alto título em embriões produzidos in vitro não propiciou sucesso. Palavras-chave: bovino, sexagem de embriões, inibição do desenvolvimento, anticorpos anti H-Y, fecundação in vitro ABSTRACT In vitro produced bovine embryos at morula stage were cultured in medium containing high titer of rat H-Y antisera for 24h. The embryos were classified in two groups: 1) embryos arrested at morula stage (classified as males); and 2) embryos that developed and formed a blastocoele (classified as female

Objetivo do presente trabalho foi comparar a performance de sêmen de cachorro in vitro e in vivo com soro de albumina bovina – tris (TB) e diluente de gema de ovo com Tris (TR). Para isso, foram usados vinte cães como doadores. O sêmen dos cães foi colhido via massagem peniana. Semanalmente a fração rica espermática foi colhida até quarenta ejaculados. Após o exame macroscópico e microscópico, as amostras foram diluídas em partes iguais de cada ejaculado com (TB e TE), pelo método one-step a 32º C. O sêmen foi embalado em palhetas francesas de 0,5 mL, as quais apresentaram características normais antes e após o congelamento. Foi avaliado a integridade cromossômica pelo método de coloração azul tripan giemsa, observando-se espermatozóides vivos intactos (LI), vivos com reação (LR), mortos intactos (DI), mortos com reação (DR). Os espermatozóides foram identificados pelo tempo de descongelamento e após 4 horas de incubação a 39ºC, o (TE) foi significativamente superior ao TB (P < 0,01) nas variáveis LI e LR. O TB foi significativamente superior ao TE (P < 0,01) na variável DR. Cadelas no estro natural foram submetidas à inseminação artificial, vinte delas recebendo sêmen com TE e vinte recebendo sêmen com TB mediante o uso de uma pipeta de Osiris ( IMV, L‘Aigle, France). Os resultados indicaram que o grupo TE foi significativamente melhor que TB (P < 0,01) em relação à taxa de prenhez e ao número de filhotes. Concluiu-se neste estudo que o grupo TE foi melhor que TB, porque isto induziu a uma reação acrossômica mais precoce no sêmen canino.