RESUMO -Realizou-se a otimização da imobilização por agregados enzimáticos reticulados (Cross-Linked Enzyme Aggregates CLEAs) de β-galactosidase (EC 3.2.1.23) de Kluyveromyces lactis. A metodologia de preparo dos CLEAs consiste na precipitação da proteína e entrecruzamento com grupos amino reativos livres em sua superfície, via reação com um reagente bifuncional. Dessa forma, foram avaliados os rendimentos de imobilização de derivados preparados com diferentes agentes precipitantes (polietilenoglicol 400, álcool terc-butílico, acetona, dimetoxietano, etanol e sulfato de amônio), diferentes concentrações de agente entrecruzante (0, 0,3, 0,6 e 1 mM) e presença de proteína espaçadora soja nas proporções mgSoja/mgEnzima 2 e 4 e mmolGutaraldeído/gProteína Total 2, 2,5 e 3. O derivado que apresentou rendimento de imobilização máximo de 74,6% foi preparado utilizando álcool terc-butílico, glutaraldeído na razão 2 mmolG/gProteína Total e razão entre proteína espaçadora soja e enzima, respectivamente, 0,4 mg/0,2 mg.
INTRODUÇÃOOs chamados agregados enzimáticos reticulados (Cross-linked Enzymes AggregatesCLEAs) são obtidos por meio da preparação e imobilização enzimáticas em um único passo. A metodologia consiste na precipitação da proteína e entrecruzamento com grupos amino reativos livres de lisina em sua superfície, via reação com um reagente bifuncional, tal como glutaraldeído (Sheldon, 2010). A metodologia CLEA, demonstrada pela Figura 1, é simples, amplamente aplicável, não requer uma enzima altamente purificada ou uma matriz sólida (Sheldon et al., 2013). O método pode, ainda, estabilizar as estruturas quaternárias de enzimas multiméricas (Wilson et al., 2004).Figura 1 -Representação da preparação dos CLEAs. A enzima solúvel é agregada pela ação de um precipitante e, em seguida, ocorre o entrecruzamento dos agregados enzimáticos pela ação de um agente intercruzante.